SIRT2在结肠癌微环境CD4^(+)T细胞向Th17细胞分化中的作用及对HIF-1α的影响

目的:探讨沉默信息调节因子2(SIRT2)过表达在结肠癌微环境CD4^(+)T细胞向Th17细胞分化中的作用及对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响。方法:小鼠结肠癌细胞CT26过表达SIRT2,构建稳定SIRT2过表达的CT26细胞株(CT26/SIRT2),qRT-PCR、Western blot检测SIRT2、HIF-1α水平;CCK-8验证SIRT2过表达对CT26细胞增殖能力的影响;24只健康C57BL/6小鼠随机分为CT26组、CT26/SIRT2组,分别接种CT26细胞、CT26/SIRT2细胞,28 d后处死小鼠,Ki67染色、TUNEL染色分别观察小鼠肿瘤组织细胞增殖与凋亡,并测定组织匀浆上清液中IL-17、IL-6水平;利用流式细胞术分离Th17细胞,qRT-PCR、Western blot检测Th17细胞中SIRT2、HIF-1α水平。结果:与CT26细胞相比,CT26/SIRT2细胞SIRT2 mRNA、蛋白水平升高,HIF-1αmRNA与蛋白水平降低(P<0.05);CT26、CT26/SIRT2细胞的增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05);与CT26小鼠相比,CT26/SIRT2小鼠剥离瘤体体积与重量、Ki67阳性表达,小鼠肿瘤组织Th17细胞比例、组织匀浆上清液中IL-17、IL-6水平、Th17细胞HIF-1αmRNA与蛋白水平均降低(P<0.05);肿瘤组织细胞凋亡率、Th17细胞SIRT2 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。结论:SIRT2可抑制结肠癌微环境CD4^(+)T细胞向Th17细胞分化,并下调HIF-1α表达。

IL-22诱导类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞分泌 IL-6促进 Th17细胞分化的研究

目的：探讨白细胞介素-22（IL-22）刺激类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASF）产生白细胞介素-6（IL-6）的水平，及间接调控IL-17＋CD4＋T（Th17）细胞分化的能力。方法分离RASF 6例，建立体外培养体系，IL-22刺激RASF，qRT-PCR及ELISA检测IL-6的表达；IL-22R1封闭抗体及抑制剂实验检测IL-6产生所涉及的特异性受体及其下游信号通路；建立RASF与健康志愿者CD4＋T细胞共培养体系和Transwell 体系，流式细胞术检测体系中各组 Th17细胞比例。结果 IL-22刺激RASF呈时间和剂量依赖性产生IL-6（P＜0．05），且IL-6产生依赖于IL-22R1及其下游的p38和JAK2通路（P＜0．05）；共培养体系和Transwell体系中发现IL-22预刺激RASF组较未刺激组Th17细胞比例增加，阻断IL-22R1或IL-6均能降低Th17细胞比例。结论 IL-22刺激RASF产生IL-6，进而促进Th17细胞分化，中和IL-22是RA治疗的有效策略。

过表达miR-498通过下调STAT3抑制类风湿性关节炎患者Th17细胞分化

本文旨在探讨微小RNA-498(miR-498)影响类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中Th17细胞分化的作用机制。从50例RA患者和50例对照人群中分别收集外周血,分离PBMCs。流式细胞术检测CD4^+IL-17^+T(Th17)细胞或者CD4^+FOXP3^+T(Treg)细胞比例,并分析Th17/Treg比值。Real-time PCR检测细胞中miR-498和STAT3基因表达,Western blot检测STAT3的蛋白表达,ELISA检测外周血血清或细胞上清中IL-17的浓度。荧光素酶报告基因实验验证miR-498靶向结合STAT3的3’非翻译(3’untranslated region,3’UTR)。miR-498 mimic或/和pc DNA-STAT3瞬时转染CD4^+T细胞,进一步考察miR-498影响Th17细胞分化的机制。结果显示,RA患者的PBMCs中,Th17细胞比例显著高于对照,且Th17/Treg比值也显著高于对照(P<0.05)。miR-498低表达而STAT3高表达于RA患者的PBMCs中,且RA患者血清中的IL-17浓度显著高于对照(P<0.05)。在转染野生型STAT3报告基因质粒的细胞中转染miR-498 mimic/inhibitor后,荧光酶活性、STAT3的基因和蛋白表达均明显改变(P<0.05),但是在转染突变型STAT3报告基因质粒的细胞中转染miR-498 mimic/inhibitor,上述指标没有显著变化(P>0.05)。此外,miR-498 mimic转染CD4^+T细胞后,显著降低Th17细胞比例,且细胞分泌IL-17的水平减少(P<0.05),而与pcDNA-STAT3共转CD4^+T细胞后,Th17细胞比例明显提高,细胞分泌IL-17的水平增加(P<0.05)。以上结果提示,在RA患者CD4^+T细胞中,过表达miR-498靶向下调STAT3,进而抑制Th17细胞分化。

整合素aV亚基在类风湿性关节炎中的表达及其与Th17细胞分化的关系

目的研究类风湿性关节炎(RA)患者整合素aV亚基的表达,分析其与辅助性T细胞17(Th17)分化的关系。方法选取30例类风湿性关节炎患者(RA组)、20名健康体检者作为对照组,运用流式细胞术(FCM)检测外周血PBMCs中Th17细胞和调节性T细胞比例以及PBMCs和树突状细胞DCs中表达整合素aV亚基的CD11c^+αν^+DC比例。结果与对照组相比,RA组Th17/Treg细胞比值显著升高(P<0.05);RA患者外周血及DCs中CD11c^+αν^+DC细胞在CD11c^+DC中占比均高于对照组(P<0.05);Spearman相关性分析发现RA患者中树突状细胞整合素aV亚基的表达与Th17/Treg细胞比值呈正相关(r=0.478,P<0.05)。结论整合素aV亚基可能参与类风湿性关节炎患者Th17细胞分化的调控。

强直性脊柱炎患者H3K27me3表达水平及其调控Th17细胞分化的表观遗传机制

目的 探讨强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)中组蛋白H3K27me3甲基化及其调节酶JMJD3和EZH2在Th17细胞分化中的作用,以揭示其在AS发病机制中的潜在作用。通过分析H3K27me3的甲基化状态及其与Th17相关因子之间的相互作用,为AS的临床治疗提供新的策略和靶点。方法 采集84名AS的患者(活跃期、稳定期各42例)和84名健康志愿者(对照组)血液样本,ELISA检测Th17细胞及相关细胞因子(IL-21、IL-22和IL-17),RT-PCR分析Th分化关键信号通路RORc、JAK2、STAT3基因的表达,蛋白质印迹法检测RORc、JAK2/STAT3通路蛋白、H3K27me3及相关蛋白酶EZH2、JMJD3的表达。对活动期AS患者H3K27me3、EZH2、JMJD3与Th分化关键信号通路分子的关联性进行Pearson相关分析。结果 RORc、JAK2、STAT3 mRNA表达,活动期组>稳定期组,差异有统计学意义(P<0.05)。H3K27me3、EZH2的表达量,活动期组<稳定期组<对照组,差异有统计学意义(P<0.05);JMJD3、RORc、JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3的表达量,活动期组>稳定期组>对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。活动期组Th17比例及其炎性因子的表达水平高于其他两组(P<0.05)。H3K27me3与RORc、JAK2、STAT3、IL-17负相关,JMJD3与JAK2、STAT3、IL-17正相关,而EZH2与JAK2、STAT3、IL-17负相关(P<0.05)。结论 AS中H3K27me3的低表达受到基因位点JMJD3和EZH2的影响,可以调节Th17细胞的分化,从而在AS的发病和进展中发挥作用。

中医药干预类风湿关节炎Th17/Treg平衡的研究进展

类风湿关节炎(RA)是一种以慢性滑膜炎为特征的自身免疫性疾病,目前发病机制尚不明确。随着对RA研究的深入,学者发现调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞(Th,主要是Th17细胞)免疫调节异常是其发病机制研究的热点,Th17细胞主要分泌IL-17,介导炎症反应过程,是RA发病机制中的主要效应细胞;Treg细胞作为具有独特调节作用的免疫抑制细胞,主要通过分泌TGF-β、IL-10等发挥作用。两种细胞的分化发育相互制约,Th17细胞的增多,Treg细胞的减少,可导致Th17/Treg平衡失调,而出现滑膜炎症、关节破坏、骨侵蚀等,加剧RA的发生、发展。近年来,中医药针对Th17/Treg失衡的治疗发现,阻止Th17对RA的致病作用,提高Treg细胞对RA的保护作用,调节Th17/Treg的平衡成为治疗RA的新途径。本文拟就Th17、Treg细胞分化、平衡关系以及中医药对Th17/Treg失衡的干预进行综述,以期为RA的机制研究和临床防治提供新思路。

构建反转录病毒小向导RNA表达载体用于小鼠T细胞基因功能研究

目的·构建反转录病毒小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达载体,用于小鼠T细胞分化调控及其基因功能的研究。方法·表达短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的反转录病毒载体(MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP)经过Xho1和Sal1双酶切后,回收得到反转录病毒载体骨架。以慢病毒sgRNA表达载体为模版,通过PCR扩增获得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段。利用同源重组将U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段组装进反转录病毒载体骨架。为了验证系统的有效性,设计靶向Il17a、Rorc和Irf4的sgRNA序列并进行克隆。分离Cas9转基因小鼠CD4 T细胞分别进行sgRNA反转录病毒感染,诱导其向Th17细胞分化。细胞因子染色,流式检测Il17a阳性细胞比例。2组独立样本数据比较采用非配对t检验。结果·①成功构建反转录病毒sgRNA载体。②利用反转录病毒载体向小鼠CD4 T细胞递送sgRNA并实现Il17a基因敲除。③Rorc-sgRNA和Irf4-sgRNA阳性群体中,Il17a阳性群体比率显著降低(P<0.05)。结论·利用sgRNA反转录病毒载体成功向目的细胞递送sgRNA并实现基因敲除。Rorc和Irf4基因敲除结果提示该系统可用于小鼠T细胞基因功能研究。

基于生物网络分析技术浅析“肺与大肠相表里”理论

目的利用现代生物网络研究肺炎与结肠炎的共性病机,基于此探讨“肺与大肠相表里”理论。方法在GeneCards数据库分别查询肺炎、结肠炎的相关靶点,根据相关性得分筛选得出两种疾病的主要靶点并进行交集,得到二者共有靶点;利用Metascape数据库对肺炎、结肠炎主要靶点及共有靶点进行分析,同时通过DAVID数据库对共有靶点进行富集分析;使用Cytoscape 3.7.2软件构建网络图。结果预测出肺炎和结肠炎的发生存在TNF、IL-10、IL-6、IL-2、IL-4、TLR4、TLR2、CXCL8、IL-17A、IFNG等54个共同靶点,并主要富集于Cytokine-cytokine receptor interaction、T cell receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和Jak-STAT signaling pathway等通路上。Metascape数据库的模块化分析结果显示:有11个模块与肺炎发生有关、6个模块与结肠炎发生有关、2个共有模块与肺炎和结肠炎发生同时相关。结论肺炎与结肠炎之间存在共同的致病靶点和作用机制,并最终通过炎症反应、免疫应答等相互作用,可以尝试用现代分子机制阐释“肺与大肠相表里”理论。