全悬浮培养ST细胞增殖猪瘟兔化弱毒株的工艺研究

本试验利用生物反应器对ST细胞全悬浮培养参数以及猪瘟病毒的繁殖工艺进行探索。从培养基、细胞接种浓度、病毒接毒量三个方面进行工艺优化,放大培养,建立了猪瘟病毒的全悬浮培养工艺。结果表明:当细胞接种浓度为1.0×10^(6)/mL、病毒接毒MOI为0.05、采用培养基1进行培养时,病毒含量达到10^(7.5)FAID_(50)/mL,工艺验证两次,结果都符合要求,稳定可靠,为猪瘟疫苗大规模全悬浮培养奠定了基础。

猪瘟病毒石门株在ST细胞连续传代后E0基因变异分析

为了解猪瘟病毒(CSFV)石门(Shimen)株连续传代后变异情况,根据已发表的CSFV E0基因序列(AF092448.2),设计合成引物,以在ST细胞中连续传代培养的CSFV石门株细胞毒总RNA为模板,每5代通过RT-PCR方法扩增病毒的E0基因,测定其核苷酸序列和氨基酸序列,用DNA Star软件分析比较原代、5代、10代、15代、20代、25代接毒细胞中CSFV E0基因的变异性。结果显示,接种病毒第10代的病毒E0基因在630核苷酸位点出现变异,第15代病毒在632核苷酸位点出现变异。本研究通过分子生物学方法发现CSFV Shimen株在ST细胞连续传代过程中E0基因能保持遗传的稳定性。

猪瘟病毒弱毒C株ST细胞传代疫苗对仔猪的免疫效果

将猪瘟病毒弱毒C株ST细胞苗以不同剂量(106 TCID50和105 TCID50)免疫28日龄仔猪,通过临床症状观察、病理剖检和组织病理学观察、抗体检测、特异性淋巴细胞增殖试验及抗原检测等方法评价疫苗免疫效果。结果表明:该疫苗接种仔猪后无任何临床症状,无病毒血症,无排毒现象;不同剂量免疫组,在2免后10 d左右猪瘟特异性抗体阳转,抗体水平于2免后20 d左右达到峰值。以上结果表明,猪瘟弱毒疫苗毒株C株的ST细胞传代疫苗对仔猪安全有效。

微载体浓度与细胞接种密度对ST细胞生长的影响

选择合适的微载体浓度、细胞接种密度以提高微载体利用率,优化微载体培养体系猪睾丸细胞(Swine testicle cells)的贴附生长与维持。使用DMEM补加10%血清、LSM(Low serum medium)两种培养基考察微载体浓度、细胞接种密度对细胞生长维持的影响,进而比较ST细胞在不同条件下对Cytodex1微载体的利用率。结果显示,使用LSM在T150方瓶中连续传代培养30d,平均比生长速率为0.626d^(0-1),是DMEM补加10%FBS培养基的1.15倍。选择10×10~5cells/mL细胞接种3g/LCytodex1搅拌瓶体系,最大细胞密度为38.3×10~5cells/mL,微载体利用率上升到58.8%。在灌注培养体系中培养ST细胞15d,最终细胞密度达到36.6×10~5cells/mL,扩增了13.6倍。微载体悬浮培养的使用一方面有利于ST细胞的贴附与生长,实现高密度生长,另一方面增加了微载体的使用成本,选择合适的微载体浓度、细胞接种密度,能够最大化利用微载体与培养基中的营养物质实现细胞的最优生长。

猪传染性胃肠炎病毒诱导ST细胞凋亡的初步研究

【目的】探讨猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染猪睾丸细胞(ST细胞)后是否可诱导细胞发生凋亡,并对凋亡的信号通路进行初步探究,为进一步揭示TGEV的致病机制提供理论基础。【方法】用TGEV感染对数生长期的ST细胞,同时设立对照组,在感染后不同时间取细胞样品,通过细胞形态观察、细胞活性检测、细胞凋亡率检测和细胞内Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性检测及Western blot分析等方法,研究TGEV感染对ST细胞的影响。【结果】TGEV感染可抑制ST细胞生长,并且呈现病毒感染剂量和感染时间的依赖性。倒置显微镜和荧光显微镜观察结果显示,10MOI(感染复数)的TGEV感染24h后,ST细胞出现典型的凋亡特征,细胞皱缩变圆、聚堆,细胞核内染色质固缩。流式细胞仪检测及Caspases活性检测表明,感染TGEV的ST细胞凋亡比例随感染时间的延长而逐渐增加,细胞内Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性逐渐升高。Western blot分析表明,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9无活性的酶原形式随着TGEV感染时间的延长逐渐降解,同时Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化片段逐渐增加。TGEV感染能够促进FasL和Bax的表达而下调Bcl-2的表达。【结论】TGEV感染能够诱导ST细胞凋亡,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9及FasL介导的死亡受体通路和Bcl-2家族调控的线粒体凋亡通路,在调控TGEV感染诱导的细胞凋亡过程中可能起着非常重要的作用。

猪睾丸(ST)细胞系作为猪瘟活疫苗生产用细胞基质的研究

为评估猪睾丸(ST)细胞系作为猪瘟活疫苗生产用细胞基质的可行性,本试验取猪睾丸(ST)基础细胞库、工作细胞库不同代次细胞分别进行致瘤性检验和胞核学检验。结果表明,ST细胞在传代过程中无致瘤性且染色体遗传稳定。本试验取不同代次的ST细胞繁殖猪瘟病毒液并测定其毒液效价;取不同代次的ST细胞繁殖的猪瘟病毒分别对猪进行免疫攻毒测定其免疫原性。结果表明,将ST工作细胞传至第30代,其仍能良好地表达猪瘟病毒,且产毒稳定,病毒滴度高,连续收毒,病毒产量高,其所表达的猪瘟病毒仍保持良好的免疫原性。上述结果表明,猪睾丸(ST)细胞系适宜作为猪瘟活疫苗生产用的细胞基质。

猪ST细胞染色体制备及核型分析

运用空气干燥法制备了猪ST细胞不同代次染色体标本，并对猪ST细胞基础细胞库细胞（63代）、最高限制代次（80代）细胞及高于最高代次10代（90代）细胞进行了核型比较分析，结果表明：猪ST细胞染色体数目2n=38。并且对其进行了着丝粒定位，试验结果表明：1～4号为亚中央着丝粒染色体，5～6为亚端着丝粒染色体，7～12为中央着丝粒染色体，13～18为端着丝粒染色体，一对性染色体。在基础细胞库中存在的染色体标志，在最高代次细胞中也存在，与基础细胞库细胞相比，所有细胞的染色体模式数均低于10％，并且核型相同。

猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞的克隆和鉴别

本研究采用有限稀释法将ST细胞进行克隆,将获取的单克隆细胞放大培养后接种猪瘟兔化弱毒株(C株),通过实时荧光定量RT-PCR技术定量检测毒液中病毒含量,筛选对猪瘟兔化弱毒株敏感的细胞株。试验结果获得D3株、C4株、C8株、D5株、E10株、E11株、F9株和H9株共8株ST单克隆细胞。其中,C4株和E11株细胞对C株高度易感,收获毒液RNA拷贝数能够维持在106 copies/mL,并且高峰期毒液拷贝数可达107 copies/mL。

黄芩多糖对PRV感染猪睾丸细胞的作用及其差异基因表达分析

为研究黄芩多糖对伪狂犬病毒(PRV)感染猪睾丸(ST)细胞的作用并筛选与调控相关的差异基因,本试验建立PRV感染ST细胞模型,将其分为预防、治疗和杀毒模式,分别使用不同浓度的黄芩多糖溶液进行处理,每个模式下设立空白对照组和PRV对照组。采用CCK-8法检测黄芩多糖对ST细胞存活率的影响,显微镜观察各组细胞形态,ELISA检测IFN-γ、IFN-α和TNF-α细胞因子含量;在24 h时提取RNA进行转录组测序,分析其差异表达基因并进行GO功能和KEGG通路分析。结果显示,PRV感染ST细胞出现病变。与PRV对照组相比,黄芩多糖浓度为97.66μg/mL时,3种模式中细胞存活率均极显著升高(P<0.01),细胞病变减轻,IFN-γ和IFN-α含量均极显著提高(P<0.01),TNF-α含量极显著降低(P<0.01),治疗指数(TI)分别为2、4和4。治疗模式下,97.66μg/mL黄芩多糖处理组、空白对照组和PRV对照组比较共交集差异基因74个,其中SOCS3、VEGFA、ZBTB18、CLCN6、RSBN1、RBM47和TET2基因差异表达较为显著,差异表达基因显著富集到15条信号通路,PRV对照组与空白对照组和PRV对照组与黄芩多糖治疗组比较,差异表达基因主要分别涉及核糖体、内吞、MAPK、TNF和MAPK、mTOR、TLR等相关通路。结果表明,黄芩多糖对PRV感染ST细胞具有保护作用,其作用可能是通过调节TNF信号通路和TLR信号通路中SOCS3、CCL5、FOS、PIK3R1和MAP3K8等相关基因的表达来实现。本试验结果将为进一步探索黄芩多糖调控PRV感染宿主的作用机制提供理论依据。

猪瘟病毒衣壳蛋白的细胞核定位研究

为了解猪瘟病毒(CSFV)衣壳(C)蛋白在ST细胞中的定位情况,本研究将CSFV C蛋白基因克隆于真核表达载体pEGFP-C2中,构建重组质粒pEGFP-CSFV-C。将该重组质粒转染ST细胞,转染2 h、4 h和6 h后利用激光共聚焦显微镜分析C表达蛋白在细胞中的定位情况。结果表明,CSFV表达蛋白在ST细胞中主要定位于细胞质和核仁。本研究为进一步分析CSFV的复制机理提供依据。

乙型脑炎病毒感染猪睾丸细胞的miRNA表达谱差异分析

[目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的miRNA表达谱并进行差异分析。使用miRanda软件对表达差异显著miRNA的靶基因进行预测并对靶基因进行GO分析。选取6个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证。[结果]与正常ST细胞相比,JEV感染后的ST细胞有112个差异表达miRNA,其中80个miRNA上调表达,32个miRNA下调表达。经RT-qPCR方法验证6个差异表达的miRNA结果与高通量测序结果一致。差异表达miRNA靶基因的生物学功能相对集中在细胞代谢、细胞黏附等生物过程。[结论]检测和分析JEV感染后猪睾丸细胞的miRNA表达谱,获得了大量的与JEV感染相关的miRNA表达谱数据,为揭示JEV感染生殖系统致病机制提供了有效的数据和理论基础。

猪瘟病毒亚基因复制子及其细胞系的构建

为探索猪瘟病毒(CSFV)的复制机理,本实验在前期CSFV流行株GD53全基因组测序的基础上,利用新霉素抗性基因(Neor)替换病毒结构蛋白基因以构建CSFV GD53株的亚基因组复制子(GD53-SGR)。首先构建含有T7-5'UTR-N^(pro)-Neor-EMCV/IRES-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3'UTR的重组质粒pc DNA-GD53-SGR,将其利用T7 RNA聚合酶经体外转录制备的RNA转录本转染猪睾丸细胞系(ST)后,利用G418筛选含有GD53-SGR的ST细胞,构建ST-GD53-SGR细胞系。酶切鉴定及测序结果表明,重组质粒pc DNA-GD53-SGR构建正确,利用T7 RNA聚合酶体外转录后获得了与预期大小一致的GD53-SGR RNA。经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定结果表明,获得了含有GD53-SGR的ST细胞系。本研究构建的CSFV ST-GD53-SGR细胞系有助于进一步了解CSFV非结构蛋白的功能,同时为CSFV的复制机制研究及抗病毒药物的研发奠定基础。

稳定表达T_7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系的建立

根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。

浒苔多糖体外抗猪传染性胃肠炎病毒研究

为研究浒苔多糖体外抗猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的效果,用水煮醇沉法从浒苔中提取浒苔多糖粗品,细胞维持液倍比稀释后,以猪睾丸细胞(ST)为细胞模型,采用细胞病变效应(CPE)试验,通过直接杀灭、抑制病毒复制和阻断病毒吸附3个方面进行研究。结果表明,浒苔多糖对ST细胞最大安全浓度为1.57mg/mL;浒苔多糖在体外对TGEV作用2h的最小杀灭浓度为0.2mg/mL,作用4h的最小杀灭浓度为0.1mg/mL;浒苔多糖浓度越高对TGEV复制的抑制作用越明显,TGEV感染细胞时间越长,对TGEV复制的抑制作用越低,抑制TGEV复制的最小浓度为1.57mg/mL;浒苔多糖对TGEV吸附ST细胞阻断作用的最小浓度与浒苔多糖作用于ST细胞的时间有关,2h为0.393mg/mL,4h为0.2mg/mL。浒苔多糖在体外对TGEV具有直接杀灭和阻断吸附的作用,为浒苔多糖抗病毒功能提供了理论依据。

添加肝素对猪睾丸细胞增殖的影响

猪睾丸细胞(ST细胞)主要用于猪瘟等病毒的培养。猪睾丸细胞增殖试验结果表明,通过在常规培养基中添加肝素用来培养ST细胞,可有效增加细胞密度,改善细胞生长状态,有望为ST细胞工厂化转瓶生产提供指导依据。

激流式生物反应器制备猪瘟高效细胞苗

在应用激流式生物反应器培养猪瘟病毒(CSFV)试验中,通过提升单位体积的细胞数量可以有效地提升抗原的效价。二种工艺从单位体积细胞数上比较,转瓶培养细胞数可达到2.5×10~5个/mL,反应器是1.5×10~6个/mL,反应器培养的细胞数是转瓶的6倍;从病毒滴度方面相比,转瓶制备的猪瘟抗原效价最高可达到40万RID/mL,反应器可达到60万RID/mL,反应器比转瓶培养的抗原效价提升50%。

应用新型CephodexD微载体培养ST细胞增殖CSFV

应用新型CephodexD微栽体悬浮培养ST细胞增殖猪瘟病毒（CSFV），并与常规单层静置培养法进行比较。新型微栽体悬浮培养的ST细胞密度72h可达18．9×10 5cells／mL，是单层静置培养工艺的2倍以上；病毒滴度最高可达7．5×10 5RID／mL，较单层静置培养法提高了50％；在一个生产流程中，能比传统培养工艺多收获2次合格病毒液。而且，采用新型微载体悬浮培养工艺生产的CSFV，能够刺激猪体产生特异性的中和抗体，对猪的保护率达100％，具有很好的免疫原性。因此，新型微栽体悬浮培养工艺较单层静置培养法更有技术优势，在CSFV大规模生产领域具有重要的应用价值。

生产用细胞基质中猪细小病毒污染检测方法的建立及应用

目的：建立生产用细胞基质中猪细小病毒（ porcine parvovirus，PPV）污染的检测方法，并进行方法学性能验证分析及初步应用。方法针对编码非结构蛋白NS1保守序列设计引物和探针，建立荧光定量PCR方法，对方法的线性、精密度、最低检出限等参数进行验证，并分析待测样品对试验的干扰。将PPV毒种感染ST细胞，制备病毒。以ST细胞为敏感细胞，建立PPV ST细胞感染性试验，并将ST细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合，建立ST细胞感染-PCR法，分析感染-PCR方法的灵敏度。利用所建立的方法进行生产用细胞样本的初步应用研究。结果 PPV荧光定量PCR法的特异性较好，与其他种属的细小病毒、猴SV40病毒及其他猪源病毒无明显的交叉反应，在109～104拷贝／μl范围内线性较好，R2达到0．98以上，灵敏度为1×10^4拷贝／μl，试验内和试验间的Ct的精密度均＜5％，试验内病毒定量拷贝数的精密度为5％～15％，试验间为30％～40％，最低感染性病毒滴度检测限为1CCID50／ml。待测细胞样品成分对病毒检测无明显的干扰性。 ST细胞感染-PCR法的灵敏度为0．01CCID50／ml。利用荧光定量PCR法对22份细胞样品进行检测，结果均为阴性。结论成功建立了PPV荧光定量PCR检测法及ST细胞感染-PCR法，能够用于细胞中PPV的检测，有助于进一步提高生产用或治疗用细胞的安全性。

新型CephodexD微载体在猪瘟病毒大规模增殖中的应用研究

旨在应用新型Cephodex D微载体悬浮培养ST细胞增殖猪瘟病毒。通过优化工艺条件初步实现了病毒抗原的大规模高效生产,培养过程采用流加方式保证ST细胞的营养供应。用含6%（v/v）无牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）及其抗体的双阴牛血清MEM生长液培养ST细胞。当达到3.8×10^9个细胞时,接种入生物反应器中,Cephodex D微载体用量为4 g/L。当反应器内ST细胞生长至48 h,接种猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）液。继续培养4 d后进行首次病毒收获,之后每3 d收获1次,直至第5次收毒结束。整个培养过程持续18d,细胞培养至72 h,密度可达2.8×10^6cells/m L,生产的CSFV滴度均在100万兔体反应量（RID）/m L以上。较现有的国家标准相比,应用生物反应器和新型Cephodex D微载体悬浮培养技术,不仅病毒滴度提高了1倍,而且整个生产周期缩短了5 d,大大提高了生产效率。因此,本研究采用的新型微载体悬浮培养工艺在CSFV大规模生产中具有重要的应用价值。

猪瘟病毒生物反应器低血清培养及其免疫效力检测

目的利用生物反应器低血清培养基灌流培养猪瘟病毒,制备猪瘟病毒活疫苗,检测其免疫效价。方法对猪睾丸ST细胞进行低血清培养驯化,待ST细胞适应低血清培养后,接种至生物反应器,当细胞达到接种密度后,感染猪瘟兔化弱毒株(Classical Swine)毒种,培养96 h后,连续收液48 d,收获的病毒液经滤膜过滤后,制备猪瘟病毒活疫苗。将疫苗免疫健康新西兰家兔和28日龄健康仔猪,检测病毒滴度及免疫效价。结果用2%血清培养ST细胞,细胞接毒密度为5×106个/m L,病毒按3%~5%比例接种。利用上述条件培养的猪瘟病毒连续收获20次,病毒滴度均在7 500 RID/m L以上。免疫仔猪后第14天抗体效价达1∶128,未免疫仔猪抗体效价低于1∶16;攻毒后观察16 d,免疫仔猪无任何猪瘟临床表现,保护率100%,而未免疫仔猪在攻毒后第6天开始陆续死亡,死亡率100%。结论用低血清培养ST细胞制备的猪瘟病毒活疫苗具有较高的免疫效价,为猪瘟病毒疫苗生产工艺的改进奠定了基础。