杜梨果实多糖提取方法及含量测定的研究

分别采用超声波-微波协同萃取、微波、水浴及超声波4种方法提取杜梨果实多糖,用蒽酮-硫酸比色法测定多糖的含量。结果表明,4种提取方法存在明显的差异,以超声波-微波协同萃取效果最佳,其后依次是微波、水浴及超声波。4种方法提取下多糖的含量分别为13.91%、13.56%、12.74%和11.06%,葡萄糖浓度在25.15～100.6μg.mL-1范围内呈现良好的线性关系,平均回收率为100.5%,RSD为1.59%(n=5)。超声-微波协同萃取提取杜梨果实多糖的方法优于微波、水浴及超声波法提取,蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量的方法准确,重复性好。

杜梨铵转运蛋白基因的克隆表达及在梨属植物中的SNP分析

利用EST并结合RACE方法从杜梨幼苗克隆获得1个AMT基因(PbAMT1;2).分析显示,PbAMT1;2cDNA全长1 811 bp,开放阅读框为1 515 bp,其对应基因组DNA序列不含内含子.PbAMT1;2编码的蛋白由504个氨基酸组成,具有11个跨膜域,1个N-糖基化位点、3个酪蛋白激酶磷酸化位点和8个蛋白激酶C磷酸化位点.同源性分析发现,PbAMT1;2与其他植物的AMT具有较高的一致性,其中与百脉根LjAMT1;2的一致性为80.23%,与拟南芥AtAMT1;2的一致性为78.68%,与番茄LeAMT1;2的一致性为77.80%.系统进化树分析表明,PbAMT1;2属于AMT1亚家族.半定量RT-PCR结果显示,PbAMT1;2主要在根部表达,而在茎和叶中几乎没有表达.以杜梨、豆梨、砂梨、白梨、秋子梨和西洋梨等6种梨属植物的DNA为模板,高保真Taq酶PCR扩增AMT1;2基因ORF区DNA序列,发现6种梨属植物的AMT1;2 ORF区DNA序列长度均为1 515 bp,相似性高达99.48%,但在44个核苷酸位点中存在SNPs,导致18个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/34.43 bp,核苷酸变异度为2.9%,氨基酸变异度为3.57%.

超声-微波协同萃取法提取杜梨果实多糖

目的提取杜梨果实多糖,并测定其含量。方法采用超声-微波协同萃取法和常规水浴提取杜梨果实多糖,并用蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量。结果超声波-微波协同萃取法比较常规水浴法提取杜梨果实多糖效果更好,两种方法提取多糖的含量分别是13.91%和12.74%;葡萄糖浓度在25.15～100.6μg·ml^(-1)范围内呈良好的线性关系,平均回收率为100.5%,RSD1.59%(n=5)。结论超声-微波协同萃取法可作为杜梨果实多糖提取的首选方法,蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量的方法准确,重复性好。

杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白PbCBL10基因的克隆和表达特性研究

【目的】为了探明杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白（CalcineurinB—likeprotein，CBL）基因的序列特征和表达特点，【方法】以杜梨幼苗为试材，运用同源克隆和半定量RT—PCR对PbCBLIO基因进行克隆和表达分析。【结果】结果表明．PbCBLIO基因编码区cDNA长度为801bp，编码的多肽由266个氨基酸组成。该多肽预测的等电点为4．56，估计的相对分子质量为30．45ku。其对应基因组DNA序列长1983bp，包括9个外显子和8个内含子。通过PSORT进行亚细胞定位分析发现PbCBLl0蛋白位于质膜上的几率最大。PbCBLIO基因编码的多肽具有4个钙离子结合域EF手形结构和1个钙调磷酸酶A亚基结合位点。PbCBLl0与番茄S1CBLIO（NP_001239045）和拟南芥AtCBLl0（NP_195026）蛋白间的同源性较高，分别为82％和77％，并与AtCBL10亲缘关系最近。PbCBL10基因在杜梨幼苗根、茎和叶片中均为诱导型表达，50～200mmol·L^（-1）CaCl2、20μmol·L^（-1）ABA、100mmol·L^（-1）NaCl、10％（w／v）PEG6000或180mmol·L^（-1）甘露醇处理后其表达量明显上调。【结论】PbCBLIO基因具备植物CBL基因家族的固有特征，能够响应胞内钙浓度变化，对ABA、盐碱、干旱和渗透胁迫均存在转录响应。

杜梨CBL1和CBL7基因对非生物逆境的响应

【目的】克隆2个杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)基因,并对其序列特征、表达特点及抗逆功能进行比较研究。【方法】采用电子克隆、RT-PCR和长片段PCR克隆了PbCBL1和PbCBL7的cDNA和DNA序列,利用生物信息学方法进行序列分析,半定量RT-PCR检测它们的表达特点,原核表达初步比较研究上述2个基因的抗逆功能。【结果】杜梨PbCBL1 cDNA编码区为642 bp,编码213个氨基酸,对应基因组DNA序列长2 969 bp;PbCBL7 cDNA编码区为639 bp,编码212个氨基酸,对应基因组DNA序列长1 788 bp;PbCBL1和PbCBL7均由8个外显子和7个内含子组成。PbCBL1和PbCBL7编码的多肽均具有植物类钙调磷酸酶B亚基蛋白结合Ca2+所必需的4个EF手型结构和1个典型的植物钙调磷酸酶A亚基结合位点。未经处理的杜梨幼苗(对照)根和叶中PbCBL1和PbCBL7的表达非常微弱,NaCl、PEG6000、甘露醇和ABA处理后,它们在根和叶中的表达均上调,且PbCBL1在叶片中的表达量显著增加。2个CBL基因分别转入大肠杆菌BL21(DE3)后,均能够明显减轻NaCl、甘露醇和PEG6000对菌株的生长抑制,而转PbCBL1菌株的抗逆效果较为明显。【结论】PbCBL1和PbCBL7基因具备植物CBLs基因家族的固有特征,对盐碱、干旱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录响应,上述基因的转入能够提高大肠杆菌BL21(DE3)对盐胁迫和渗透胁迫的耐受能力,转PbCBL1菌株的抗逆功能强于转PbCBL7菌株。

盐胁迫下的杜梨PbPYL4基因克隆及其与PbNCED2基因表达分析

【目的】分离和克隆杜梨ABA受体蛋白基因Pb PYL4,了解其在杜梨响应盐胁迫的表达情况。【方法】以杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)无性系组培苗为试验材料,使用RT-PCR的方法从杜梨中克隆到ABA受体基因,命名为PbPYL4,并研究该基因盐胁迫处理下的表达模式,同时检测ABA合成基因Pb NCED2在盐胁迫下的表达模式。【结果】PbPYL4的c DNA长度为682 bp,其中开放阅读框(ORF)621 bp,编码207个氨基酸的蛋白。系统发生分析结果表明,PbPYL4与植物中已经发现的拟南芥ABA受体蛋白PYL4/RCAR10亲缘关系较近。荧光定量RT-PCR表达分析结果表明,根,盐胁迫12 h内,Pb PYL4基因被诱导表达,12 h达到第1个小高峰,随后24 h表达下降,48 h表达又上升,72 h达到第2个峰值;茎,盐胁迫48 h后,Pb PYL4基因被诱导表达;叶片,处理12 h后,Pb PYL4基因被诱导表达,72 h表达略微下降。在同样组织中,Pb NCED2表现出与Pb PYL4相似的表达时序。【结论】Pb PYL4基因可能在杜梨响应盐胁迫的过程中起了重要的作用。

杜梨PbCBL10基因表达与启动子功能分析

【目的】类钙调磷酸酶B亚基蛋白(Calcineurin B-like proteins,CBLs)参与调控植物生长发育及在响应逆境胁迫过程发挥重要作用。深入探明杜梨CBLs家族成员PbCBL10在逆境下的表达模式并在转录水平上揭示表达差异,为揭示梨抗逆机制提供理论依据。【方法】以杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)幼苗为试材,运用实时荧光定量RT-PCR技术分析了PbCBL10在Na Cl、Ca Cl2、甘露醇(Mannitol)、聚乙二醇(PEG6000)、脱落酸(ABA)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)和温度诱导下的表达特性;通过基因组步移技术分离PbCBL10启动子序列,并利用生物信息学方法对其功能进行预测;构建启动子植物表达载体并通过农杆菌介导法转化烟草,研究多种胁迫及激素诱导下GUS蛋白瞬时表达情况。【结果】RT-qPCR分析表明:PbCBL10表达受Na Cl、Ca Cl2、甘露醇、PEG6000、ABA、6-BA、NAA和温度诱导;获得了长度为919bp的PbCBL10启动子序列,该序列含有典型调控元件与多个胁迫顺式元件;瞬时表达结果表明,多种胁迫与激素作用因子均可诱导PbCBL10启动子调控GUS基因的表达。【结论】PbCBL10参与多种激素和逆境胁迫过程的信号转导,在调控梨树生长发育及响应环境胁迫方面发挥重要作用。

杜梨CPI基因的克隆、序列分析及表达

植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cysteine proteinase inhibitor,CPI)在植物的抗逆基因工程中发挥着越来越重要的作用,分离和克隆植物CPI基因进而研究该基因的功能是植物抗逆基因工程研究的热点。为从分子水平上揭示CPI基因在杜梨防御机制中所起的作用,利用RACE和PCR方法,从杜梨种子中克隆CPI基因的cDNA和DNA序列,并采用跨内含子表达引物进行半定量RT-PCR来分析该基因在不同胁迫条件下的表达情况。结果表明:PbCPI基因cDNA长度为987 bp,开放阅读框包含738个核苷酸,编码1个由信号肽(26个氨基酸)和成熟肽(219个氨基酸)组成的多肽。该多肽预测的等电点为6.68,估计的相对分子质量为27 190。其对应基因组DNA序列由3个外显子(1～302 bp,401～772 bp,1 615～1 897 bp)和2个内含子(303～400 bp,773～1 614 bp)组成。通过PSORT进行亚细胞定位分析发现PbCPI蛋白位于内质网上。PbCPI基因编码的多肽具有植物CPI产生抑制活性所必需的一级结构:2个甘氨酸残基(Gly46-Gly47)、假定的反应域QXVXG(Q90-V91-V92-A93-G94)和A/PW基序(P120-W121);并包含植物CPI家族高度保守的特征序列模式LARFAVQEHN、QVVAG和YQAKVWVKPW。进化树分析表明PbCPI和蔷薇科植物CPI蛋白位于分子进化树的同一发育分支上,并且与苹果MdCPI(AAO19652)蛋白具有较高的一致性(95.92%)。杜梨叶片中PbCPI为诱导型表达,高温(30℃)、低温(4℃)、NaCl、机械损伤、MeJA或ABA处理4 h后其表达量明显上调,即其对温度胁迫、盐碱、机械损伤和外源激素处理均存在转录响应,这表明该基因参与了杜梨对生物或非生物胁迫的防御机制。

杜梨胆碱单加氧酶基因克隆及胁迫表达

为了解梨砧木—杜梨对非生物胁迫的防御机制,采用RT-PCR、RACE和长片段PCR技术从杜梨幼苗中获得1个甜菜碱合成相关的胆碱单加氧酶基因(PbCMO),运用生物信息学方法分析序列特点,并通过跨内含子引物进行半定量RT-PCR研究其在非生物胁迫下的表达情况。结果表明:(1)PbCMO基因cDNA序列编码区长1 227bp,编码由408个氨基酸组成的多肽。其对应基因组DNA序列长2 928bp,由10个外显子和9个内含子组成。其推导的多肽预测的等电点为6.19,相对分子质量为46.27kD,具备Rieske型铁硫[2Fe-2S]簇结合区域和非血红素单核态铁配位点序列,与枸杞CMO蛋白相似性最高(71%)。(2)PbCMO在幼苗根和叶中均为诱导型表达,100mmol/L氯化钠、10%(W/V)聚乙二醇、180mmol/L甘露醇或20μmol/L脱落酸处理后其表达量明显上调,表明PbCMO对盐碱、干旱、渗透胁迫和ABA均存在表达响应,可能参与杜梨应对非生物胁迫的转录调节。

耐盐杜梨蛋白磷酸酶基因PbPP2C的克隆及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)是植物体内脱落酸ABA信号传导关键负调控酶,在植物耐非生物胁迫中发挥着重要的作用。本研究利用RT-PCR技术,克隆出编码杜梨PP2C蛋白的基因Pb PP2C,其核苷酸序列全长1 353 bp,开放阅读框长1 263 bp,编码422个氨基酸残基,这些残基中包括了与二价金属离子结合的MED、DGH、DG和D结构域。系统发生分析结果表明,该氨基酸与拟南芥AHG3亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明:盐胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中的表达12 h达到峰值,同时在根中72 h达到第二个峰值;干旱胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中表达72 h达到峰值。说明Pb PP2C与杜梨耐盐和耐干旱胁迫存在紧密关联。

非生物胁迫下杜梨PbCBL4基因的表达

为揭示PbCBL4基因在杜梨抗逆防御机制中的作用,采用PCR方法克隆了杜梨PbCBL4基因的cDNA和DNA序列,利用半定量RT-PCR和原核表达分析了该基因对非生物胁迫的转录响应。结果表明:PbCBL4基因的cDNA长度为639 bp,编码一个含212个氨基酸的蛋白;基因组DNA长度为1 645 bp,包含8个外显子和7个内含子。PbCBL4编码的蛋白具有植物类钙调磷酸酶B亚基蛋白结合Ca2+所必需的4个EF手型结构,1个典型的植物钙调磷酸酶A亚基结合位点。PbCBL4与拟南芥AtCBL4亲缘关系最近,处于同一进化分支上。PbCBL4基因在杜梨叶中为诱导型表达,对盐碱、干旱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录响应,而在杜梨根中检测不到该基因的表达;将其转入大肠杆菌BL21(DE3)后,能够明显减轻NaCl、甘露醇和PEG6000对该菌株的生长抑制。综上所述,PbCBL4基因主要在叶片中参与了杜梨对非生物胁迫的防御机制。转入PbCBL4的重组大肠杆菌对盐胁迫和渗透胁迫的耐受能力均得到提高。

杜梨果实热水提取物对H_(22)小鼠的抗肿瘤作用

目的探讨杜梨果实热水提取物对H22小鼠的抗肿瘤作用。方法以H22(肝癌实体型)移植小鼠为模型研究杜梨果实热水提取物体内抗肿瘤作用,以及对脾脏、胸腺指数的影响。结果杜梨果实热水提取物对H22有显著的抑制作用,使荷瘤小鼠的脾脏、胸腺指数明显升高。结论杜梨果实热水提取物具有一定的抗肿瘤活性。

低温与激素处理对解除杜梨种子休眠的研究

以当年采收和自然贮藏1a的种子为试材,研究了不同浓度GA3、6-BA和低温时间等因素对不同生理状态杜梨种子休眠解除的影响。结果表明:低温25d可使自然贮藏1a的杜梨种子发芽率达到90%,使当年采收新种子发芽率达到65%以上,低温时间对萌发种子胚轴和胚根生长无差异性影响。GA3和6-BA以及低温与二者的组合处理均只对自然贮藏1a的种子促进萌发效果较好,以1000mg/LGA3和200mg/L6-BA分别浸种24h种子发芽率较高,而对当年采收新种子促进萌发作用很小,且6-BA的促进种子萌发效应要大于GA3的作用。

土壤碱胁迫下杜梨高生长与矿质元素含量的关系

为了解土壤碱化对杜梨苗期高生长和矿质营养的影响,本研究以1年生杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)幼苗为材料,在大田中通过逐级递增添加合计50L的不同浓度NaOH溶液设置了7个人工土壤碱胁迫处理(添加的NaOH浓度分别为0、100、200、300、400、500、600 mmol/L),于1个生长季内按月连续监测土壤pH和电导率,统计幼苗存活率和测量高生长,并测定根、茎、叶中铜、镁、锌、铁等4种矿质元素的含量。结果表明,添加600 mmol/L NaOH溶液处理下(pH=10.16)杜梨的存活率降至60%,相对高生长(RHG)显著低于其他6个处理(pH为9.08~10.06),整株全铁含量显著较少。在土壤pH为10.16时,杜梨幼苗根中铜含量显著少于茎、叶。此外,在pH为9.08~10.16的碱性土壤,杜梨RHG与根中铜、铁元素的含量呈显著的正相关。

杜梨果实挥发油化学成分的GC-MS分析

采用水蒸气蒸馏法从杜梨果实中提取挥发油,用气相色谱-质谱法对化学成分进行鉴定。共分离出50个峰,确定了其中的49种,所鉴定化合物的含量占全油的78.85%,18种化合物占总挥发油的62.51%,得到的挥发油为淡黄色油状物,具有浓郁的芳香气味。

棠梨籽油的超声波-微波协同提取及其脂肪酸组成

以棠梨籽为原料,研究超声波-微波协同提取棠梨籽油的最佳工艺,分析其脂肪酸组成。在单因素实验基础上,选择微波时间、超声功率、料液比和超声温度为自变量,以棠梨籽油出油率为响应值,采用响应面分析法,考察超声波-微波协同提取棠梨籽油的最佳工艺;采用气相色谱分析棠梨籽油脂肪酸组成。结果表明,最佳提取工艺条件:液料比为3.45 mL·g^(-1)、超声温度为70.00℃、组合时间为超声10 min-微波30.00 s、组合功率为超声120 W-微波480 W,棠梨籽出油率为34.78%。棠梨籽油中脂肪酸组成以不饱和脂肪酸为主,其中油酸24.29%、亚油酸60.94%。本研究为棠梨籽油的进一步开发利用提供了科学依据和技术参考。

影响野生杜梨种胚离体培养的因素

研究了离体培养条件下不同浓度激素、活性炭、低温及其处理方式和种皮等因素对打破杜梨种胚休眠促进萌发的影响。结果表明,1/2MS培养基上附加GA3和6-BA可以有效地促进去皮杜梨种胚的萌发,以6-BA的促进萌发作用优于GA3,其中分别以7.5 mg/L 6-BA和15.0 mg/L GA3促进萌发和成苗效果较好,但根系发育以附加GA3的培养基为好,易发生侧根。低温和去种皮处理均有利于种胚的萌发,且表现接种后低温预培养方式优于低温处理后再接种培养。活性炭有利于侧根的发生,以0.1%水平促进萌发成苗作用较好;IAA具有很好的促进生根的作用,平均生根率可达89.54%,且以IAA为2 mg/L时侧根条数较多。

杜梨花挥发油化学成分的研究

采用水蒸气蒸馏法从杜梨花中提取挥发油,用气相色谱-质谱法对化学成分进行鉴定。共分离出46个峰,确定了其中的45种,所鉴定化合物的含量占全油的87.84%,主要化学成分为:二十一烷(60.05%);二十八烷(4.48%);(E,E)-3,7,11-三甲基-2,6,10-三烯十二-1-醇(4.43%);6,10,14-三甲基-2-十五酮(2.27%);2-甲氧基[1]苯噻吩-[2,3-c]喹啉-6(5H)-酮(1.98%);Iron,monocarbonyl-(1,3-butad iene-1,4-d icarbon ic ac id,d iethyl ester)a,a'-d ipyridyl(1.61%);[(2-氟苯)甲基]-1H-嘌呤-6-胺(1.07%);1,2-苯二羧酸-二异辛酯(1.02%)。以上八种化合物占总挥发油的76.91%,所得挥发油为淡黄色油状物,具有浓郁的芳香气味。

杜梨古树种质嫁接技术研究

为保存、获取大量优质杜梨古树种质资源,以当年生杜梨幼苗为砧木,接穗采用年前采自不同种源地的优质杜梨古树枝条,采用插皮接法和双舌接法2种方法于今年1月和3月进行嫁接试验。结果显示,采用插皮接法于3月嫁接的成活率达到86%,嫁接成活的杜梨新梢株高年均生长量与新梢直径年均生长量最大,分别为85和1.20 cm。综合嫁接成果率与成活植株生长情况来看,该项技术以插皮接法最好,嫁接时间以3月为最佳,砧木应选择当年生杜梨实生苗。

杜梨甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及非生物胁迫下的转录反应

盐胁迫是限制作物生长和产量的主要环境因素之一,它直接导致植物组织和细胞的水分丧失。为了防御细胞失水,植物积累渗透保护物质甘氨酸甜菜碱（Glycine betaine,GB）来维持植物细胞的渗透平衡[1]。植物GB合成以甜菜碱醛为底物,由甜菜碱醛脱氢酶（BADH）催化生成。不同植物BADH基因的mRNA转录水平均受到盐胁迫诱导上[2-5]