TET2重塑CXCR4 DNA甲基化对急性心肌梗死小鼠心肌组织自噬、炎症反应及凋亡的影响

目的:探究急性心肌梗死(AMI)过程中内皮细胞tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)对趋化因子受体4(CXCR4)DNA甲基化的影响以及对AMI小鼠心肌组织自噬、炎症反应及组织细胞凋亡的影响机制,为临床探究AMI发展的分子机制提供理论依据。方法:8周龄雄性C57/BL6小鼠50只,制备AMI模型,尾部注射TET2、CXCR4过表达质粒;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测心肌组织TET2、CXCR4、微管相关蛋白3(LC3)、P62、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)关联X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl-2表达;甲基化检测CXCR4 DNA甲基化水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌组织内炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测各组心肌组织细胞凋亡指数。结果:与假手术组比较,模型组心肌组织内TET2、CXCR4均表达上调,TET2、CXCR4均在心肌组织内过表达,TET2过表达促进CXCR4表达,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,TET2 mimic组CXCR4启动子区域DNA甲基化程度降低,CXCR4蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与假手术组比较,模型组小鼠心肌组织自噬蛋白LC3、抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2表达下调,炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平、自噬蛋白P62、促细胞凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);TET2、CXCR4过表达进一步下调LC3、Bcl-2蛋白表达,上调炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平,P62、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达;TET2、CXCR4二者联合体现出最低LC3、Bcl-2蛋白表达,最高炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平以及P62、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:AMI发展中,TET2通过降低CXCR4 DNA甲基化,促进CXCR4基因表达,进而抑制AMI小鼠心肌组织自噬,上调炎症反应及细胞凋亡程度,促进疾病发展。

猪场环境源大肠杆菌的耐药性调查及携带mcr-1和tet(X4)菌株的传播特征

养殖场中抗菌药的长期使用促使耐药菌株快速出现和传播,并可以通过粪肥和污水向环境排放,给公共卫生带来巨大威胁。为了调查猪场环境源大肠杆菌的耐药情况,评估耐药基因的传播风险,本试验采集163份猪场粪便、污水和土壤样本,通过平板划线分离培养法分离大肠杆菌,通过药敏试验检测分离菌株对14种抗菌药物的耐药情况,聚合酶链式反应(PCR)检测临床重要耐药基因,脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测菌株间的亲缘关系,接合试验和质粒复制子分型检测接合子的质粒类型。结果显示,共分离获得150株大肠杆菌,其中粪便源大肠杆菌耐药情况最严重,污水源大肠杆菌次之,土壤源大肠杆菌最低;污水源大肠杆菌耐药基因检出种类最多,粪便源大肠杆菌次之,土壤源大肠杆菌最少。10株携带黏菌素耐药基因mcr-1大肠杆菌和18株携带替加环素耐药基因tet(X4)大肠杆菌分离自粪便和污水样本,且多重耐药情况较为严重。10株携带mcr-1大肠杆菌经PFGE分为9种脉冲场图谱,其中9株与大肠杆菌C600接合成功,接合子中有IncFIA、IncW、IncFIB、IncI2和IncP五种质粒类型;18株携带tet(X4)大肠杆菌经PFGE分为15种脉冲场图谱,其中16株与大肠杆菌C600接合成功,接合子中有IncFIB、IncFrepB和IncHI1三种质粒类型。结果表明,必需持续监测猪场环境中的临床重要耐药基因,特别需要关注mcr-1和tet(X4)基因的流行情况,并且在养殖中合理使用黏菌素和四环素类抗生素。

ASXL1、TET2阳性急性髓系白血病免疫表型及预后研究

目的探讨ASXL1、TET2阳性急性髓系白血病(AML)患者的免疫表型及临床预后。方法纳入2019年1月1日-2022年5月31日期间于蚌埠医学院第一附属医院就诊的162例初诊AML(M3型除外)患者的临床资料,其中ASXL1和TET2双突变组(ASXL1^(+)TET2^(+)组)患者10例,ASXL1突变组(ASXL1^(+)组,包括双突变组)患者26例,TET2突变组(TET2^(+)组,包括双突变组)患者25例,无ASXL1或TET2突变组(双阴性组)患者121例。通过对4组患者免疫表型及预后进行回顾性分析,比较4组患者的完全缓解(CR)率、中位无进展生存时间(PFS)和中位总生存时间(OS)。结果4组患者在年龄、性别、WBC、RBC、Hb、PLT计数和FAB分型上差异无统计学意义(P>0.05);与双阴性组相比,ASXL1^(+)TET2^(+)组、ASXL1^(+)组和TET2^(+)组异常染色体核型的发生频率更高(P=0.046),且初诊时骨髓原始细胞数低(P=0.037)。ASXL1^(+)组患者CD7、CD33和CD38、CD34抗原表达率低于双阴性组(均P<0.05)。CASXL1^(+)TET2^(+)组、ASXL1^(+)组和TET2^(+)组首次CR率均低于双阴性组,且ASXL1^(+)TET2+组总CR率低于双阴性组(均P<0.05)。双阴性组中位PFS和OS均较ASXL1^(+)TET2^(+)组、ASXL1^(+)组和TET2^(+)组显著延长(均P<0.05),其中ASXL1^(+)TET2^(+)组中位OS较TET2^(+)组明显缩短(P=0.019),较ASXL1^(+)组存在缩短的趋势(P=0.055)。结论ASXL1是一个不良预后的指标,合并TET2突变可能缩短了AML患者的生存时间。

Tet-On系统中多西环素对MBD1诱导表达的调控研究

【目的】构建甲基结合蛋白1(MBD1)的Tet-On可诱导表达质粒和293T细胞,探讨多西环素(Dox)对MBD1表达的影响,并通过分析细胞中质粒启动子CpG甲基化水平反映MBD1调控机制。【方法】使用MBD1引物扩增293T的MBD1表达序列,将其连接于Tet-On诱导表达质粒的多克隆位点;将构建成功的质粒用电转染的方法转入MBD1 KO 293T,使用荧光显微镜及Western blot验证获得的MBD1恢复的293T(MBD1 RE 293T);使用不同浓度Dox诱导MBD1表达,利用Western blot检测单克隆细胞中MBD1的表达情况;使用同一浓度Dox诱导MBD1表达,在12、24、48、96、144、192 h收集细胞,利用Western blot检测细胞中MBD1的表达情况;使用亚硫酸氢盐测序方法检测Dox诱导后细胞内可诱导质粒启动子CpG甲基化情况。【结果】成功构建Tet-On诱导表达MBD1质粒;与未诱导细胞相比,Dox诱导后转染细胞MBD1蛋白重新表达;随着Dox浓度的升高细胞中MBD1的表达逐渐增多;相同浓度Dox诱导后,从12-96 h细胞内MBD1的表达逐渐升高,但144 h后MBD1表达下降;细胞内质粒启动子CpG甲基化检测显示,与96 h相比,144和192 h质粒启动子甲基化水平逐渐升高;在诱导144 h加入甲基转移酶抑制剂地西他滨(decitabine)后,质粒启动子甲基化水平降低,MBD1表达升高。【结论】Tet-On可诱导细胞中重新表达MBD1蛋白,并且表达量与Dox浓度正相关,但长时间诱导后细胞内质粒CpG甲基化水平升高,影响细胞中MBD1的表达。

寻常型银屑病患者皮损组织中DNA去甲基化酶TET3过表达介导转录因子KLF4显著高表达

目的 探讨银屑病患者皮损组织中Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4, KLF)异常高表达的DNA甲基化分子机制。方法 以20例寻常型银屑病患者病理检查所取皮损组织为实验组,13例眼外伤手术患者所取眼睑皮肤组织为对照组。采用亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing, BSP)检测各组皮肤样本及转染十-十一转位3(ten-eleven translocation 3, TET3)过表达及干扰质粒的人永生化角质形成细胞HaCat中转录因子Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)启动子区DNA甲基化水平,RT-qPCR和Western blotting检测各组皮肤组织样本及转染HaCat细胞中KLF4、TET1(ten-eleven translocation1)、TET2、TET3的表达水平。结果 实验组KLF4启动子DNA甲基化水平显著低于对照组(P<0.01),实验组KLF4的mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01)。实验组KLF4启动子DNA甲基化水平与mRNA表达水平呈显著负相关(r=-0.649,P=0.002)。实验组TET3表达水平显著高于对照组(P<0.01), TET1及TET2表达水平差异无统计学意义。实验组TET3表达水平与KLF4启动子DNA甲基化水平呈显著负相关(r=-0.688,P=0.001)。HaCat细胞中过表达TET3后,KLF4启动子DNA甲基化水平明显下调(P<0.01),KLF4表达水平显著上调(P<0.01)。HaCat细胞中干扰TET3表达后,KLF4启动子DNA甲基化水平明显上调(P<0.01),KLF4表达水平显著下调(P<0.01)。结论 过度表达的TET3通过下调KLF4启动子DNA甲基化水平,介导银屑病患者皮损组织中KLF4过度表达。

高含S-腺苷甲硫氨酸饮食通过TET3介导的DNA去甲基抑制小鼠脑卒中后神经元细胞凋亡及活性氧蓄积

目的 明确高含S-腺苷甲硫氨酸(SAM)饮食是否通过激活10-11易位蛋白3(TET3)促进DNA去甲基化,抑制脑卒中后小鼠神经元细胞的凋亡及活性氧(ROS)产生。方法 将C57BL/6J小鼠分为Sham组、大脑中动脉栓塞(MCAO)组和SAM组。术后行Morris水迷宫实验评价小鼠神经功能状态,对小鼠脑组织进行取材、切片、苏木精-伊红染色、氯化三苯基四氮唑(TTC)染色及免疫荧光染色。将PC-12细胞分为Control组、缺氧/复氧(H/R)组和SAM组。流式细胞仪检测细胞ROS水平及凋亡水平;Western blot检测细胞中TET3相对表达量;Dot blot检测细胞内5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)水平。结果 在动物实验中,与Sham组相比,MCAO组小鼠神经功能缺损加重,脑梗死区域明显,脑组织结构排列紊乱且存在大量空洞,神经细胞数量减少,脑切片中TET3蛋白表达减少,5hmC水平降低;而与MCAO组相比,SAM组小鼠神经功能缺损情况减轻,脑梗死区域体积减小,脑组织中的空洞减少,存活神经细胞增多,TET3蛋白表达增多,5hmC水平升高。在细胞实验中,与Control组相比,H/R组缺氧处理可促使细胞内产生大量ROS,诱导细胞发生凋亡,胞内TET3蛋白表达减少和5hmC水平下降;而与H/R组相比,SAM组细胞ROS产生减少,细胞凋亡减少,TET3表达增多和5hmC水平上升。给予TET3抑制剂可消除SAM减少细胞凋亡的作用。结论 高含SAM饮食通过促进TET3介导的DNA去甲基化减轻小鼠脑卒中后神经元损伤,从而发挥保护作用。

TET2敲除对小鼠心肌纤维化、肥大及相关基因蛋白表达影响

目的研究野生型及TET2基因敲除小鼠心肌基因、蛋白表达变化,探讨TET2敲除影响心肌肥厚、纤维化可能的作用机制。方法使用Trizol试剂法提取心肌组织RNA,RT-qPCR法检测WT及TET2-/-小鼠TET2、CYGB、COL3a、POSTN、Nur77、PPARγ、RBP7、GSTA3、SNCA、TPPP3、ELN、LEMD2、Piezo-1的mRNA表达水平变化;使用RIPA裂解液提取心肌总蛋白,Western blot法进行检测TET2、Col3a、Col1a、SM22、Nur77、PPARγ、ELN、LEMD2、α-SMA、DNMT1的蛋白表达水平;使用HE染色检测心肌细胞肥厚;Masson染色检测心肌纤维化。结果核酸凝胶电泳检测到野生型和TET2敲除小鼠;TET2敲除小鼠心肌横截面积及细胞直径和纤维化程度明显增加。q-PCR和蛋白电泳显示TET2敲除导致DNMT1、Col1a、Col3a、α-SMA、POSTN、CYGB表达上调,LEMD2、SM22、Nur77、PPARγ、RBP7、GSTA3、SNCA、TPPP3、Piezo-1、ELN表达下调,而CLDN1的蛋白表达没有明显差异。结论TET2的敲除可能通过介导DNMT1表达影响DNA甲基化状态来影响心肌细胞的发育;TET2的敲除可能会影响LEMD2收缩舒张功能;TET2的敲除上调Col3a及Col1a表达增加胶原蛋白沉积、POSTN mRNA表达上调,下调SM22表达导致心肌纤维化,下调ELN的表达影响心肌顺应性;增加CYGB和下调GSTA3、SNCA、Piezo-1表达可能导致心肌氧化应激发生导致心肌纤维化的发生;下调Nur77、PPARγ、RBP7的表达可能致使TET2敲除小鼠心肌纤维化、心肌细胞肥大发生;TET2敲除小鼠α-SMA表达上调,心肌细胞发生肥大。

广东省某生猪屠宰场tet(X4)和bla_(NDM)阳性菌的流行特征

为了探究广东省某生猪屠宰场中替加环素耐药基因tet(X4)和碳青霉烯耐药基因bla_(NDM)阳性菌的流行特征,本试验从广东省某生猪屠宰场采集94份不同来源样品(55份猪粪便、20份屠宰场环境和19份猪胴体),使用含替加环素和美罗培南的麦康凯琼脂培养基筛选替加环素和美罗培南不敏感菌株;采用PCR方法检测tet(X4)和bla_(NDM)基因阳性菌,并对阳性菌进行菌种鉴定;采用微量肉汤稀释法和琼脂稀释法测定阳性菌的药物敏感性。结果显示,所有样品的tet(X4)和bla_(NDM)阳性菌检出率分别为93.62%(88/94)和51.06%(48/94),其中tet(X4)基因阳性菌的检出率在猪粪便样品中最高(98.18%,54/55),其次是胴体样品(89.47%,17/19)和环境样品(85.00%,17/20);bla_(NDM)因阳性菌的检出率在环境样品中最高(80.00%,16/20),其次是猪粪便样品(47.27%,26/55)和胴体样品(31.58%,6/19)。2种耐药基因的主要携带菌种均为大肠杆菌,分别占比95.65%(88/92)和74.07%(40/54),另外也检测到tet(X4)阳性的弗格森埃希菌、阴沟肠杆菌和摩氏摩根菌,bla_(NDM)阳性的肺炎克雷伯菌、雷氏普罗威登斯菌和瓜里科州假单胞菌等。药敏试验结果显示,tet(X4)和bla_(NDM)阳性大肠杆菌均为多重耐药菌,其中tet(X4)阳性菌对四环素和氟苯尼考的耐药率为100%;bla_(NDM)阳性菌对头孢噻肟和头孢他啶的耐药率为100%;2种基因阳性菌均对黏菌素较为敏感。结果表明,该屠宰场tet(X4)和bla_(NDM)阳性菌污染严重,主要菌种为大肠杆菌。屠宰场tet(X4)和bla_(NDM)阳性菌的污染对食品安全和公共卫生构成威胁,提示应加强对生猪屠宰场中耐药菌污染情况调查和长期监测。

TET甲基胞嘧啶双加氧酶2在心血管疾病发病机制中的研究进展

心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是中国人最主要的死亡原因。动脉粥样硬化、心肌细胞凋亡、心肌肥厚和纤维化是CVD主要的病理过程。基因的表观遗传修饰特别是DNA甲基化在CVD中起重要作用。研究表明,TET甲基胞嘧啶双加氧酶2(Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 2,TET2)参与基因表观遗传调控,TET2在CVD的发病机制中起重要作用。TET2可以调节心脏发育、改善动脉粥样硬化过程中内皮细胞功能障碍、调节血管平滑肌细胞表型转换、抑制免疫炎症反应和心肌细胞凋亡、心肌肥厚和纤维化。本文就TET2在CVD发病机制中的研究进展进行综述。

克隆造血DNMT3A基因突变、Tet2基因缺失对慢性阻塞性肺疾病炎症反应调控作用的研究进展

克隆造血是指造血系统体细胞基因突变的非恶性增殖性现象,可驱动基因突变后的突变白细胞比例升高。新近研究指出,由白血病驱动基因突变引起的克隆造血可通过促炎反应影响慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发生发展。越来越多的研究显示,克隆造血是COPD的非传统、独立的危险因素,同时也是导致COPD发生的一种新机制。甲基化DNA转移酶3a(DNMT3A)基因突变及Tet2基因缺失是体细胞突变最常见的两种类型,二者可诱导炎症反应的发生,引起肺功能下降,从而导致COPD的发生发展。深入研究DNMT3A基因突变及Tet2基因缺失与COPD炎症反应的关系,可为研究COPD发生发展的相关机制提供新思路。

Research on the Deep Integration Mechanism of National Fitness Campaign and College Physical Education Teaching:Taking Guangdong University of Science and Technology as an Example

By using the methods of literature review,questionnaire survey,and expert interview,this paper discusses and analyzes the deep integration mechanism of national fitness campaign and college physical education teaching,in order to promote the development of college physical education teaching reform,expand ideas,explore new fields,and provide novel development directions.The purpose is to enhance the national physical quality,improve the public service system,enhance the health awareness of the citizens,and provide guidelines for promoting the development of sports.

miR-589-5p靶向调控TET2对人脑微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-589-5p靶向调控甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)对人脑微血管内皮细胞(hBMVECs)增殖和凋亡的影响。方法体外培养hBMVECs,进行细胞转染和双萤光素酶检测;将细胞分为对照组、LPS组、miR-NC+LPS组和miR-589-5p inhibitor+LPS组,处理24 h后检测细胞增殖率和细胞凋亡率,同时检测细胞中miR-589-5p和TET2相关mRNA和蛋白表达水平。结果检索TargetScan数据库显示,miR-589-5p对TET2有潜在的结合位点。与对照组相比,其余各组细胞凋亡率及miR-589-5p mRNA、Nod样受体蛋白3(NLRP3)蛋白、半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)-1蛋白、白细胞介素-1β(IL-1β)蛋白、Caspase-3蛋白水平均增加(P<0.05),细胞增殖率及TET2 mRNA、TET2蛋白水平均降低(P<0.05);与LPS组和miR-NC+LPS组相比,miR-589-5p inhibitor+LPS组细胞凋亡率及miR-589-5p mRNA、NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、IL-1β蛋白、Caspase-3蛋白水平均降低(P<0.05),细胞增殖率及TET2 mRNA、TET2蛋白水平均增加(P<0.05);LPS组和miR-NC+LPS组细胞增殖率、细胞凋亡率及miR-589-5p mRNA、TET2 mRNA、TET2蛋白、NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、IL-1β蛋白、Caspase-3蛋白水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论在LPS环境下,hBMVECs中的miR-589-5p表达增加,通过转染miR-589-5p inhibitor可以增加TET2表达,促进hBMVECs增殖,并抑制hBMVECs凋亡。

TET蛋白的去甲基化机制及其在调控小鼠发育过程中的作用

TET(Ten-eleven translocation)蛋白家族共有3个成员,分别为TET1、TET2和TET3,均属于α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+依赖的双加氧酶,可以将5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5 m C)氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5 hm C)、5-甲酰基胞嘧啶(5-formylcytosine,5 f C)及5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5 ca C)。研究表明,TET蛋白通过不同机制以主动或被动的方式调控DNA去甲基化,且去甲基化的活性可能受其他因子的调控。TET蛋白广泛参与哺乳动物发育过程的调节,其中在原始生殖细胞的形成、胚胎发育、干细胞多能性及神经和脑发育等方面发挥了重要作用。TET蛋白生物功能的发现为表观遗传学研究开辟了全新的研究领域,而且相关研究结果对拓展生命科学研究具有重要意义。文章综述了TET蛋白家族的结构、去甲基化分子机制及在小鼠发育过程中的作用,为深入了解TET蛋白的功能提供理论基础。

水产养殖环境常见四环素类抗生素抗性基因tet(M)的演化及传播的初步分析

利用分子系统学方法分析了20条水产养殖环境中常见的四环素抗性tet(M)基因的序列特点、多态性及系统发育,并对其细菌寄主分类、环境介质来源作相关性分析。结果表明,20条基因序列有4种单倍型,其中tet(M)-b和d是两种远缘基因型,而a和c则是二者之间的序列变异。系统发育树分成三大分支,tet(M)基因在进化及传播过程与其细菌寄主的基因背景及环境介质的来源并无严格的相关性,暗示该类基因在环境中传播与进化迅速,其传播机制及环境毒性有待于深入的研究。

四环素类药物酶修饰基因-tet(X)的起源、分布及在环境中的作用

抗性基因作为一类严重威胁人类健康和生命安全的新型环境污染物,近年来引起了广泛的关注.四环素类抗性基因是环境和临床上研究得最多的一大类抗性基因,目前已报道的相关基因共有44种,包含泵出、核糖体保护和酶修饰3种主要机制.相对于前两种机制,酶修饰机制关注得不多.tet(X)是唯一一种研究较为透彻的酶修饰基因,它编码的蛋白可化学修饰和降解四环素,广泛存在于各种环境介质中,对临床耐药性的发展具有一定的贡献.本文综述了tet(X)基因的研究进展,指出有必要重新认识tet(X)对环境中四环素类生物降解的贡献及其对于细菌四环素耐药性发展的重要性,并对tet(X)的未来研究方向进行了展望.

TET蛋白:一个新的DNA修饰酶家族

DNA的胞嘧啶(C)5-甲基化是一种重要的表观修饰,它参与基因调节、基因组印记、X-染色体失活、重复序列抑制和癌症发生等过程.5-甲基胞嘧啶(5mC)可被TET(ten-eleven translocation)蛋白家族进一步转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),该过程是DNA去甲基化的1个必要阶段.5hmC可在活性转录基因起始位点和Polycomb抑制基因启动子延伸区域富集.TET蛋白包括3个成员TET1、TET2和TET3,均属于α-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶,其催化涉及氧化过程.小鼠Tet1在胚胎干细胞发育中拥有双重作用,即促进全能因子的转录,又参与发育调节因子的抑制.人TET蛋白的破坏与造血系统肿瘤相关,如在骨髓增生性疾病/肿瘤存在频繁的TET2基因突变.TET蛋白和5hmC的研究为DNA甲基化/去甲基化及其生物学功能提供了新的视点.

副猪嗜血杆菌江西分离株药物敏感性及四环素耐药基因tet(B)分析

为了解副猪嗜血杆菌江西株的药物敏感性及其耐药基因,本实验采用K-B法测定分离株对57种药物的敏感性,结果显示20株副猪嗜血杆菌均对阿洛西林和万古霉素敏感,80%及以上的分离株对氨苄西林\舒巴坦、阿莫西林\棒酸等高度敏感。但分离株对恩诺沙星、氨曲南、四环素等的耐受性较强,某些菌株对多种药物具有抗性,其中6株菌能够耐受5种药物,5株菌能够耐受12种药物,3株菌能够耐受13种药物,甚至有2株菌能够耐受多达22种药物。将江西分离株的药物敏感性结果与其它国家或地区以及不同时间分离菌株的结果相比较表明,不同地区及不同时间段分离的菌株药物敏感性存在较大差异。为探索副猪嗜血杆菌耐药的分子机制,本研究设计引物并建立了检测四环素耐药基因tet(B)的PCR方法。运用所建立的方法检测江西株tet(B)基因,在15株四环素耐药菌株中检测出其中9株菌存在该基因,推测tet(B)可能是介导该菌对四环素耐药的主要分子机制之一。

四环素调控的真核表达体系Hep3B Tet-On细胞株的建立

目的 建立可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体系Hep3BTet On细胞株 ,用于基因功能的研究。方法 将pTet On质粒用脂质体介导法转染Hep3B细胞 ,经G4 18筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化。单克隆分别扩增后 ,瞬时转染pTRE luc(编码荧光素酶蛋白 )质粒 ,Dox诱导表达后 ,检测荧光素酶活性 ,逐一筛选四环素调控高表达外源基因的Hep3BTet On细胞株。结果 成功构建了一株受Dox调控的高表达低背景的Hep3BTet On细胞株。结论 Hep3BTet On细胞株可用于外源基因的真核调控高表达 ,为研究真核基因功能提供了一种有力的实验手段。

5-羟甲基胞嘧啶及其TET氧合酶在神经系统发育和相关疾病中的研究进展

神经系统的正常发育是多种因素相互协调作用的结果,一旦特定因素失衡将引起相关疾病的发生。近年来不断有研究发现,DNA去甲基化过程的一类中间产物5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hm C)作为一种新的表观遗传标记,在神经系统中高水平分布,并参与认知、记忆等重要的神经功能。5hm C的形成由氧合酶家族分子(ten-eleven translocation protein,TET)催化,在多种神经系统相关疾病中,5hm C水平和TETs分子的表达都发生改变,提示TET-5hm C表观遗传机制在复杂的神经系统发生发展过程中发挥了重要的调控作用。此外,作为基因表达调控的DNA标记物,5hm C的基因定位与基因表达水平的关系也是重要的研究方向。本文就近年来5hm C和TET家族蛋白分子在神经系统发育和相关疾病方面的重要研究发现进行了综述总结,希望为相关领域研究人员深入开展研究提供重要的思路,并为相关疾病设计治疗策略提供理论支持。

CX26/CX32缝隙连接蛋白的Tet-onHeLa细胞模型的建立及鉴定

目的体外建立一种特异性快速有效观察药物对细胞缝隙连接(GJ)作用的特异性细胞模型,为发现作用于GJ的药物以及GJ的特异性研究提供一种有力的技术手段。方法构建同时双向表达2种不同连接蛋白(CXs)的质粒;用表达CX26/CX32的质粒转染Tet-on HeLa细胞,建立稳定表达CX26/CX32并形成异质性GJ的HeLa细胞模型。设置多西环素(Dox)(1μg/mL)处理组和未处理组,分别用RT-PCR和Western blot法检测细胞CX26 mRNA和蛋白质表达;细胞接种荧光示踪法检测细胞GJ功能;丽丝胺罗丹明B(SRB)法检测细胞的增殖。在上述细胞模型上,用GJ抑制剂2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-APB)和GJ激活剂维甲酸(RA)干预。结果 HeLa细胞无内源性CX的表达,Dox可诱导Tet-on HeLa细胞CX26 mRNA和蛋白质表达,并且被诱导表达的CX可形成有效的GJ。2-APB(50μmol/L)减少稳定表达CX26/CX32的HeLa细胞间的荧光传递数目,GJ抑制率为51.3%(P<0.01);RA(10μmol/L)增多细胞间的荧光传递数目,GJ增强率为60.3%(P<0.01)。结论成功建立Dox调控的、稳定表达CX26/CX32的Tet-on HeLa细胞模型,为寻找可调节GJ功能的药物、观察药物对GJ的特异性作用提供了有力的实验手段。