体外培养牛白细胞中环形泰勒焦虫(Theileria annulata)的增殖、释放与感染

在体外培养的牛外周血白细胞中,环形泰勒焦虫裂殖子与裂殖体寄生于宿主细胞的细胞质中,并且随着宿主细胞的分裂而分到两个子细胞中。焦虫染色质粒的分裂方式为二分裂,随着焦虫颗粒的不断增殖,逐渐发育为成熟的裂殖体。体外培养感染焦虫的牛白细胞可通过伪足与细胞裂解两种途径向培养液中释放焦虫颗粒。释放到培养液中的焦虫颗粒对体外培养的健康牛外周血白细胞具有感染能力,感染细胞能在体外连续传代培养。

Milk losses due to bovine tropical theileriosis(Theileria annulata infection) in Algeria

The authors studied the impact of tropical theileriosis onset on milk yield decrease in 10 local bred cows in Skikda(Northern Algeria) during 2015 summer season.The milk yield decrease estimated weekly during two months was 2.76 L/day/cow corresponding to31.92% of the total milk yield.This decrease corresponds to 110.5 Algerian Dinars(1.02US$)/day/diseased cow.The relative variation of milk yield showed a dramatic decrease from 82.72% to 0.76% at Day 21 then became constant.Further studies are needed to improve these estimations of financial losses due to bovine tropical theileriosis in Algeria.

新疆和田地区于田县牛源环形泰勒虫种群基因型及遗传多样性分析

为探究新疆和田地区于田县牛源环形泰勒虫种群的基因型分布及遗传多样性,试验首先从该县10个乡镇(阿羌乡、喀尔克尔乡、科克亚乡、木尕拉镇、斯也克乡、先拜巴扎镇、英巴格乡、加依乡、奥依托格拉克乡、阿日希乡)采集疑似环形泰勒虫病患牛血液样本共443份,提取基因组DNA后对牛源环形泰勒虫Tams1基因进行PCR检测,统计10个乡镇牛源环形泰勒虫的阳性样本数及阳性率;然后在发现阳性样本的乡镇中,每个乡镇随机选取2个阳性样本进行测序,将测序结果进行同源性分析并与参考序列共同构建NJ系统发育树,分析基因型;最后对于田县环形泰勒虫种群进行遗传多样性分析。结果表明:在443份牛血液样本中,有93份样本环形泰勒虫检测结果为阳性,阳性率为20.99%;10个乡镇中有9个乡镇牛源环形泰勒虫检测结果为阳性,阳性率在10.45%~45.45%之间,其中阿羌乡阳性率最高,加依乡未检出。18株环形泰勒虫Tams1基因序列的核苷酸相似性为76.0%~100%,同乡镇的2个阳性样本之间的核苷酸相似性为91.0%~100%;这18株牛源环形泰勒虫在NJ系统发育树中未全部聚为一支,一些虫株甚至与其他国内外参考毒株表现出了更近的亲缘关系,但均为G1基因型。于田县G1基因型环形泰勒虫种群多态性位点数为119个,核苷酸多样性为0.053,平均核苷酸差异数为28.95个,单倍型数为12个,单倍型多样性为0.895,Tajima’s D值和Fu and Li’s F值均小于0。说明于田县G1基因型环形泰勒虫种群具有较高的遗传多样性且正在发生扩张。

环形泰勒虫亚端粒编码可变分泌蛋白家族部分基因的研究进展

环形泰勒虫作为一种转化型泰勒虫,可感染牛单核巨噬细胞,并使其发生转化。目前,仅知环形泰勒虫通过劫持宿主细胞信号通路完成转化,但其转化机制尚未阐明。环形泰勒虫亚端粒编码可变分泌蛋白(SVSP)家族作为环形泰勒虫基因组的最大多基因家族,其在虫体-宿主相互作用中的功能尚不清楚。因此,本文通过对环形泰勒虫SVSP家族中部分基因的结构、表达特征、与宿主相互作用和可能发挥的功能进行总结,以期为环形泰勒虫-宿主相互作用机制和致病机理研究提供思路,同时也为癌症基础生物学研究提供借鉴。

牛环形泰勒虫烯醇化酶重组蛋白对小鼠免疫应答的研究

为了评估牛环形泰勒虫(Theileria annulata)烯醇化酶(enolase)原核重组蛋白对实验动物体液免疫水平和细胞免疫水平的影响,用His纯化柱和超滤管对pET-32a-enolase进行纯化和浓缩,应用Western blot分析蛋白的反应原性;另外利用牛环形泰勒虫烯醇化酶重组蛋白(r Ta-enolase)免疫Balb/c鼠制备多克隆抗体,经间接ELISA检测血清中重组蛋白的特异性抗体水平。免疫后,取小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液,用流式细胞术检测脾脏T细胞亚群情况;用MTT试剂盒检测体外刺激后T淋巴细胞增殖情况;用Spss ANOVA单因素检验进行差异显著性分析。Western blot表明,enolase重组蛋白可与阳性血清发生特异性反应。ELISA检测免疫鼠特异性IgG/IgG1和IgG2a抗体均与对照组差异极显著(P<0.01);流式细胞术检测表明,免疫组(2.53±0.11)与对照组(1.85±0.11)CD4^(+)/CD8^(+)T细胞的比值差异极显著(P<0.01);用r Ta-enolase重组蛋白刺激小鼠脾脏淋巴细胞后明显促进其增殖(P<0.05)。研究结果表明r Ta-enolase免疫小鼠能够诱导小鼠产生极高的体液免疫水平以及细胞免疫应答水平,细胞免疫应答偏向于CD4^(+)T细胞,为后续其在疫苗中的免疫功能提供数据资料。

新疆部分地区牛和骆驼常见蜱传原虫病流行病学调查

研究旨在调查新疆阿克苏地区、阿勒泰地区、昌吉州、哈密市、和田地区、伊犁州等地方的部分试验区域牛和骆驼蜱携带病原情况。通过PCR方法对所采集的507份牛和骆驼血样进行病原检测(巴贝斯虫、环形泰勒虫、立克次体、无浆体),并采用MAGA11.0软件进行系统进化分析。结果显示,3个地区(阿克苏地区、阿勒泰地区、哈密市)的环形泰勒虫病总阳性率为9.86%(50/507),其中牛的阳性率为7.81%(19/243),骆驼的阳性率为11.74%(31/264);巴贝斯虫、立克次体和无形体未检出。进化树显示,骆驼环形泰勒虫的阳性样本与中国株亲缘关系较近(登录号:OM140998),相似性为99.31%;牛环形泰勒虫与沙特阿拉伯株亲缘关系较近(登录号:OM273908),相似性为99.60%。试验对新疆6个地区牛和骆驼的蜱传疾病的感染情况进行了调查,并首次在骆驼体内检出环形泰勒虫,结果可为新疆牛和骆驼蜱传疾病的综合防控提供技术支撑。

基于TashHN基因的牛环形泰勒虫病PCR诊断方法的建立

根据Genbank已发表的环形泰勒虫TashHN基因序列设计合成引物,以此建立基于环形泰勒虫TashHN基因的PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、稳定性进行验证,并用建立的方法对宁夏固原地区各县共计135份牛血样进行检测。结果表明:建立的基于TashHN的PCR检测方法与中华泰勒虫、东方泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫均无交叉反应;可检测的最低模板浓度为1.64×10^(2) copies/μL;环形泰勒虫的DNA在-20℃冰箱放置8个月后仍可检测出目的条带;该方法利用已有文献中的PCR方法进行一致性检测,从135份牛血样中检测出5份阳性,说明该方法准确可靠。因此,试验建立的基于环形泰勒虫TashHN基因的PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、稳定性强的特点,适用于临床上环形泰勒虫早期感染检测以及流行病学的调查。

新疆一例牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体混合感染的病例初报

2021年8月17日,新疆托克逊县一头西门塔尔母牛出现高热、瘤胃胀气、肌肉震颤、呼吸急促、结膜黄染和血红蛋白尿等临床症状。为确认发病原因,采集该牛全血和体表蜱虫样品进行光学显微镜观察、血常规检测和聚合酶链式反应(PCR)检测。血涂片镜检结果显示,患牛疑似牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体混合感染;血常规检测显示,血红蛋白、血红细胞压积、平均血红蛋白浓度和中性粒细胞等指标下降,血小板和淋巴细胞百分比等指标上升,提示该牛机体存在贫血和炎症反应;血液样品PCR结果显示,牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体检测均呈阳性;蜱虫样品PCR结果显示,牛环形泰勒虫检测为阳性。综上,患牛最终被诊断为牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体混合感染。目前,此3种病原共同感染牛的案例极为少见。本研究为今后牛混合感染牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体的临床诊断提供了参考。

哈密市牛环形泰勒虫病诊断与治疗

为了探讨环形泰勒虫病诊断与防治效果,试验采用临床诊断、病理剖检、血液涂片染色镜检、PCR检测及硬蜱形态学鉴定等方法,针对2023年5月哈密市部分养殖户的牛出现发热、淋巴结肿大等症状,病死率达43.6%,为尽快控制病情,采集病牛血样60份,分别进行血液涂片检测和PCR诊断。结果表明:血液涂片的阳性率为55%;PCR检测阳性率为65%,进行测序比对分析发现,病原为环形泰勒虫,两种检测方法的阳性符合率为81.8%,其中养殖场的发病率高于散养户,改良牛的感染率明显高于本地牛,以2岁以下牛发病较为多见。对病死牛剖检肉眼可见,可视黏膜苍白或黄染、心脏外膜出血点、肝脏淤血、肿大,有暗红色病灶等病理变化。采集患牛体表寄生硬蜱,通过形态学鉴定确定为小亚璃眼蜱。说明针对不同病程,使用不同的处方治疗,牛环形泰勒虫病可得以控制。现提出诊断、治疗及预防措施,以期为环形泰勒虫病的防控提供参考。

环形泰勒虫TA13815蛋白的原核表达及反应原性分析

为研究环形泰勒虫(Theileria annulata)TA13815蛋白功能,对环形泰勒虫虫体蛋白TA13815基因的核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,构建pET30a-TA13815重组表达载体,并对其进行原核表达及反应原性分析。SDS-PAGE结果显示,蛋白的分子质量大约为29.663 ku,主要以包涵体形式表达,条带位置显示蛋白的分子质量比预期大,蛋白可能存在翻译后修饰。通过qPCR分析环形泰勒虫3个不同发育阶段,结果显示TA13815 mRNA在3个阶段均有表达,且在裂殖体阶段表达量最高。本试验成功表达了环形泰勒虫TA13815重组蛋白,该重组蛋白有较好的反应原性,且能与抗His标签蛋白的单克隆抗体和环形泰勒虫阳性血清发生特异性反应,而与健康牛血清无交叉反应。TA13815蛋白与东方泰勒虫的核苷酸和蛋白同源性均小于68%,表明该重组蛋白可作为间接ELISA诊断方法的备选抗原。

奶牛环形泰勒焦虫病的诊治报告

[目的]诊治某奶牛养殖场奶牛环形泰勒焦虫病。[方法]对香河县某奶牛养殖场患病奶牛采取流行病学调查、临床观察、血液涂片和PCR检测方法进行环形泰勒焦虫病诊断。[结果]该次疫情发病率31.25%,死亡率20.00%。患病奶牛皮肤多处分布蜱虫,临床主要表现包括发热、贫血、消瘦和体表淋巴结肿大等。镜检可见红细胞边缘呈棱角状,胞内充满寄生虫体,虫体多位于红细胞边缘,呈椭圆形、环形、梨形。利用特异性引物F/R对提取DNA进行PCR扩增,得到长度为750 bp扩增条带。该次疫情是由环形泰勒焦虫感染所致环形泰勒焦虫病。经采取中西药结合疗法,有效控制疫情蔓延。[结论]奶牛环形泰勒焦虫病要早发现,早治疗,消灭蜱虫,保持环境卫生,有效切断其传播途径,遏制疫情发展。

环形泰勒虫分泌蛋白与其转化细胞互作研究进展

环形泰勒虫是由璃眼蜱属的蜱传播的胞内寄生虫,可感染牛的单核巨噬系统的细胞和红细胞,引起牛的环形泰勒虫病,给畜牧养殖业造成严重的经济损失。与其他顶复门寄生虫不同,环形泰勒虫裂殖体可感染并转化宿主免疫细胞,使其发生永生化,具有某些癌细胞表型;同时,环形泰勒虫转化宿主细胞的特性是可逆的,这为研究胞内寄生虫与宿主细胞相互作用提供了强有力的模型。因此,对环形泰勒虫分泌蛋白与其宿主细胞的相互作用研究进展进行描述,以期为深入理解泰勒虫转化细胞机制和疫苗研制提供参考。

牛环形泰勒虫病二温式PCR诊断方法的建立及初步应用

为建立特异、敏感、快速的二温式PCR诊断方法,根据牛环形泰勒虫裂殖子表面抗原(tams1)基因,设计了一对特异性引物,扩增出大小为154bp基因片段,经克隆、测序分析,与已知基因序列的相似性为96%。用建立的牛环形泰勒虫病二温式PCR诊断方法,对从新疆牛环形泰勒虫病流行地区采集的50份全血样品进行诊断,阳性率为88%,而血涂片检出的阳性率只有58%。经试验验证,该方法具有特异性高、敏感性强、重复性和稳定性好等优点。表明本试验所建立的二温式PCR诊断方法可用于牛环形泰勒虫病的临床诊断、隐性感染检测和流行病学调查。

新疆牛环形泰勒虫虫病的流行病学调查

【目的】2006～2008年全疆14个地州的牛环形泰勒虫病流行病学调查。【方法】使用已建立的牛环形泰勒虫病间接ELISA检测方法,以纯化的重组蛋白GST-Tams1作为抗原。【结果】(1)牛环形泰勒虫病仍是新疆牛梨形病的主要病原。在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清31份,感染率为11.15%。2007年,在532份牛血清样品中检出阳性血清61份,感染率为11.47%。在2008年的530份牛血清中检出阳性血清61份,感染率为11.51%。(2)2008年,在地方流行性疫病区牛环形泰勒虫感染率高达24%。【结论】新疆牛环形泰勒虫病的特点是疫区分布广,感染率居高不下,保持在11%以上,对动物和人类构成一定的威胁。这是新疆首次利用血清学方法对全疆牛环形泰勒虫病进行大规模的流行病学调查。

新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增环形泰勒虫Tams1基因,将扩增产物与pUcm-T载体连接,重组质粒经PCR和双酶切鉴定、测序确认后被亚克隆于pGEX-4T-2表达载体中。构建的表达重组质粒经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的Tams1基因片段长846bp,为一个完整的开放阅读框,编码281个氨基酸,与GenBank中的Tams1基因核苷酸同源性在93.6%～99.8%之间;系统进化树分析表明新疆分离株与印度株、毛利塔尼亚株和北非共和国株进化途径一致,与苏丹株、巴林株进化途径相差较远;推测的蛋白质抗原决定簇预测表明,Tams1基因编码的氨基酸具有13个交叉的抗原决定簇;表达的融合蛋白为56ku,能够被环形泰勒虫多克隆血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为进一步开展牛环形泰勒虫的分子生物学诊断、亚单位疫苗和核酸疫苗的研究奠定了可靠的基础。

牛环形泰勒虫巢式PCR诊断方法的建立

根据GenBank上发表的环形泰勒虫Tamsl基因序列设计2对巢式引物，成功建立了环形泰勒虫病的巢式PCR快速检测方法。验证试验结果表明，PCR扩增产物测序结果与GenBank收录的Tamsl序列同源性在92％～99％，对环形泰勒虫检测具有良好的特异性、重复性以及灵敏度。对新疆焦虫病疫区牛群血样检测发现，巢式PCR检出率为62．2Yoo（61／98），高于常规PCR检出率（58．2％，57／98）和血涂片镜检检出率（35．7％，35／98），提示该巢式PCR方法可用于大规模的环形泰勒虫病的流行病学调查。

新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与序列分析

采用PCR技术，从新疆焦虫病疫区感染牛的全血中扩增到Tamsl基因，该基因长度为846bp，编码281个氨基酸。同源性分析表明，该基因与其他9个国际流行虫株的核苷酸同源性为93．6％～99．8％，氨基酸同源性为88．6％～99．6％。系统发育进化树分析表明，新疆分离株同印度株、毛利塔尼亚株、土耳其株、北非共和国株进化途径一致，与苏丹株和巴林株进化途径相差较远。氨基酸抗原决定簇分析发现新疆分离株编码的氨基酸有13个抗原决定簇。

牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白间接ELISA检测方法的建立

【目的与方法】以纯化的牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立检测牛环形泰勒虫血清特异性抗体的间接ELISA方法。【结果】方阵试验确定的GST-Tams1抗原的最适包被浓度为10μg/mL,血清最佳稀释倍数为80倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.282,批内和批间重复试验的变异系数均小于15%。Tams1间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与环形泰勒虫病巢式PCR检测方法的阳性符合率为96%。【结论】建立的Tams1间接ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高。这是国内首次利用重组蛋白建立的牛环形泰勒虫病血清学诊断方法,为大规模地进行牛环形泰勒虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。

小亚璃眼蜱和亚洲璃眼蜱对环形泰勒虫传播能力的研究

将实验室培养的小亚璃眼蜱 (Hyalommaanatolicumanatolicum )和亚洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticumasiaticum)清洁幼虫和若虫饲喂于感染环形泰勒虫的牛体 ,收集饱血幼虫和若虫 ,用所孵化的若虫和成虫感染试验牛。结果显示 ,小亚璃眼蜱幼虫、若虫阶段感染 ,所发育之若虫、成虫均可传播环形泰勒虫 ;而亚洲璃眼蜱各阶段的传播试验结果均为阴性。

基于环形泰勒虫Tams1基因多态性的二温式-PCR检测方法的建立

【目的】环形泰勒虫作为牛科动物重要的血液原虫对养牛业产生了重大危害。近年来针对该病原Tams1基因的诊断方法及候选疫苗筛选进行了大量工作。但研究证明该基因多态性对诊断及免疫效果存在影响。基于此,本研究对Tams1基因多态性特征进行了分析,并为该病的诊断建立一种实施有效的检测方法。【方法】参考GenBank中公布的环形泰勒虫Tams1基因的核苷酸序列,设计特异性引物。PCR扩增,获得了846 bp的核苷酸片段。将该基因片段与GenBank中主要的12种已知不同区域虫株的相应氨基酸序列进行比较分析。在保守区设计引物,以Tams1基因标准阳性质粒为模板建立环形泰勒虫病的二温式-PCR检测方法。经优化的方法用于田间样品的检测。【结果】该基因编码281个氨基酸,碱性氨基酸48个,酸性氨基酸42个,疏水性氨基酸100个。系统发生树结果显示,环形泰勒虫甘肃株与安哥拉、土耳其、巴林地方株亲缘关系较近。新疆株与意大利、西班牙地方株关系较近,而与甘肃株亲缘关系相对较远。这一结果通过环形泰勒虫不同国家地方株的氨基酸序列对齐结果可以得到进一步的说明。建立的二温式-PCR检测方法,可检测到0.31 fg.μL-1血液中感染虫体的量。特异性结果表明,仅有环形泰勒虫基因组DNA检测为阳性,其它对照虫种基因组模板均表现为阴性,且与感染牛的其它梨形虫无交叉反应。本实验建立的环形泰勒虫二温式-PCR方法对收集的335份野外样品进行检测,阳性检出率为16.33%,显微镜检测阳性率为2.25%,两者符合率100%。与普通PCR比较,二温式-PCR在敏感性方面没有显著差异,但其特异性更高,且该方法反复升温降温时间消耗短。【结论】环形泰勒虫Tams1基因不同地方株存在明显的差异。其氨基酸序列的多态性特征差异显著。因此该基因作为潜在候选抗原应注重多肽疫苗的设计。二温式-PCR方法具有的良好敏感性和特异性,对环形泰勒虫病的流行可以起到提前检测的效果,提高了疾病的诊断效率。