Experimental infectivity of Theileria luwenshuni and Theileria uilenbergi in Chinese Kunming mice

Theileria luwenshuni and Theileria uilenbergi are important tick-borne pathogens and cause substantial losses to the sheep industry in China. The improvement in detection techniques has allowed the identification of multi-homing parasitism in Theileria parasites. Herein we evaluated the experimental infectivity of T. luwenshuni and T. uilenbergi in Chinese Kunming mice by screening blood samples of experimentally inoculated mice by microscopic examination（ME） and PCR. T. luwenshuni infected Chinese Kunming mice and 20 mice inoculated with this parasite were positive by ME and PCR. In addition, T. uilenbergi infected mice and 20 mice inoculated with this species were positive by ME and PCR. However, the number of red blood cells and the levels of hemoglobin of 40 infected mice had no obvious changes in the course of infection. Our results demonstrated the multi-homing parasitism of T. luwenshuni and T. uilenbergi, which were believed to be parasites of sheep and goats. This study was the first to demonstrate the infection of T. luwenshuni and T. uilenbergi in Kunming mice.

湘西地区山羊泰勒虫流行病学调查及种类鉴定

为了解湖南省湘西自治州羊泰勒虫病感染情况及种类鉴定,本研究于2018年8月至2019年8月,应用PCR法对湘西自治州不同地区共204份山羊血液样品中泰勒虫属18S rRNA基因进行检测。结果发现,该地区羊泰勒虫病阳性率为81.86%,其中黑山羊和本地山羊阳性率分别为79.52%和83.47%;舍饲较散养羊群泰勒虫病感染率低,分别为75.78%和92.10%;随机挑选16个阳性样品进行测序与分析,结果发现,本研究获得的16份样品基因序列与吕氏泰勒虫(Theileria luwenshuni)中国流行株同源性达99.50%以上,遗传进化分析发现所有样品与吕氏泰勒虫分离株均属于同一分支。本研究结果表明,泰勒虫广泛流行于湘西地区羊群中,且吕氏泰勒虫为优势虫种,应加强对该病的防控。

吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选

【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,其初级库容量约为1.0×106PFU,扩增文库的滴度为8.2×108PFU·ml-1,文库重组率为100%;通过免疫学筛选、测序和Blast软件分析,共获得30个新基因,其中15个基因已登录GenBank/NCBI。【结论】为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原,以及发展可持续性防制羊泰勒虫病提供基本材料。

两种羊泰勒虫的形态学观察和比较

经PCR鉴定的吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫各感染1只除脾绵羊,取羊耳尖血涂片,光学显微镜观察其形态。两种泰勒虫的细胞浆呈浅蓝色,细胞核为紫色,主要形态包括梨籽形、圆形(或卵圆形)、针形、杆状、三叶草形、十字架形、逗点形和不规则形等。在整个病程中,梨籽形、圆形(或卵圆形)和针形3类虫体数量居多。两种羊泰勒虫在形态学上无明显差异。

吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫内转录间隔区基因序列的测定与系统进化分析

自试验感染吕氏泰勒虫（渭源株）和尤氏泰勒虫（隆德株）绵羊的血液中纯化虫体，提取虫体基因组DNA，通过PCR扩增内转录间隔区（ITS1-5．8S-ITS2 rRNA）基因，然后进行测序，构建了系统发生树并与GenBank中各种动物梨形虫的ITS1-5．8S-ITS2 rRNA基因序列进行比较。结果显示，这两种泰勒虫的ITS1-5．8S-ITS2 rRNA基因大小为817-842bp，同源性高达96．8％，分布在同一大枝上。通过比较ITS基因的同源性，尤其是ITS2基因的变异性，可以区别这两种泰勒虫与其他梨形虫。

试验性羊泰勒虫病的病理学观察

对用羊泰勒虫单一种人工感染的试验羊进行了病理学观察。结果显示 ,试验羊的可视黏膜苍白 ,皮下脂肪胶样水肿 ,全身淋巴结、心、肝、脾、肺和肾均有不同程度肿胀 ;实质器官组织变化的主要特征为明显的增生和巨细胞结节形成 ;淋巴结的窦内皮与网状细胞明显增生 ,甚至形成团块和条索 ;淋巴与网状内皮细胞中可见到裂殖体 ;脾还可见到坏死结节 ;肾小球毛细血管内皮细胞和间质细胞也明显增生 ;肝窦内皮的增生特别明显 ,甚至形成细胞条索 ;与淋巴结、脾、肾一样 ,肝小叶内同样有巨细胞结节形成 ,在上述巨细胞结节中均可在细胞浆中发现裂殖体 ;大脑中主要表现血管内皮与小胶质细胞增生。

吕氏泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆与序列分析

从吕氏泰勒虫宁县株中提取RNA,用RT-PCR方法扩增主要表面蛋白P32基因的cDNA片段,克隆后测定其核苷酸序列,并推导了相应的氨基酸序列。结果表明,扩增的P32基因长度为875个核苷酸,共编码284个氨基酸。核苷酸序列与已发表的牛的4种泰勒虫的主要表面蛋白基因相比较,其与瑟氏泰勒虫俄罗斯株、日本株、中国辽阳株的核苷酸和氨基酸序列相似性均在98.9%以上。其推导的氨基酸序列中有3个糖基化位点。

湘西地区吕氏泰勒虫的遗传多样性及遗传进化分析

为了探究湖南湘西地区吕氏泰勒虫的基因变异情况、遗传多样性及其遗传进化关系,试验以采集于湘西地区的16株羊源吕氏泰勒虫为研究对象,运用PCR技术扩增其核糖体18S rRNA和线粒体cox1基因序列,以此对其遗传多样性及遗传进化关系进行研究。结果表明:所获得的16株羊源吕氏泰勒虫核糖体18S rRNA基因序列的长度均为384 bp,共包含9个变异位点,种内差异为0~1.8%,种间差异为5.4%~62.1%;cox1基因序列的长度均为1092 bp,其内共含2个变异位点,种内差异为0~0.2%,种间差异为16.7%~20.4%。此外,在基于18S rRNA和cox1基因序列所构建的遗传进化树中均发现,来自于湘西地区的16株羊源吕氏泰勒虫共位于进化树的同一分支上。说明湘西地区吕氏泰勒虫之间尽管存在一定程度的基因变异,但具有较近的亲缘关系,未出现明显的遗传分化。

羊吕氏泰勒虫PCR检测方法的建立与应用

为建立一种准确、敏感的羊吕氏泰勒虫检测方法,根据Gen Bank上发表的羊吕氏泰勒虫18S rRNA基因序列(登录号:KC735166.1),设计1对特异性引物,建立了PCR检测方法。筛选该方法的最佳反应条件及体系,并进行了敏感性、特异性、重复性试验及临床血液样品检测。结果表明,该方法能扩增出大小为962 bp的羊吕氏泰勒虫特异性片段,与GenBank收录的相关参考序列同源性高达99.4%~99.9%;与绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、环形泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和弓形虫基因组DNA均无交叉反应;DNA最低检测量为29.13 fg·μL^(-1);具有良好的重复性;对76份羊临床血液样品检测结果表明,羊吕氏泰勒虫感染率为77.63%,高于已报道的常规PCR检测结果。

陕西麟游县山羊吕氏泰勒虫感染调查及其遗传进化分析

为了解陕西麟游县山羊吕氏泰勒虫感染情况,应用聚合酶链反应(PCR)方法对采自陕西麟游的209份山羊血液样品进行吕氏泰勒虫18S小亚基核糖体核糖核酸基因扩增,并对部分阳性样品进行遗传进化分析。调查显示,吕氏泰勒虫总感染率为61.2%(128/209);不同饲养方式、不同年龄、不同季节山羊的吕氏泰勒虫感染率均差异性显著(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。遗传进化分析表明,研究获得的泰勒虫分离株与吕氏泰勒虫(GenBank登录号:LC326009)位于同一分支上。该调查结果丰富了我国吕氏泰勒虫流行病学资料,并为该地区及同类地区羊泰勒虫病的防控提供科学依据。

吕氏泰勒虫抗原蛋白PIP的表达及抗原性分析

本研究通过构建原核表达系统对吕氏泰勒虫(Theileria luwenshuni)抗原蛋白PIP进行表达,并利用生物信息学软件对该蛋白的抗原表位和功能进行分析。以吕氏泰勒虫DNA为模板成功扩增目的基因PIP,构建的重组表达载体pTYB12-PIP在大肠杆菌BL21(DE3)中表达得到重组蛋白CBP-PIP。生物信息学分析结果表明,该蛋白具有一定的抗原性,41~48位、68~75位、110~116位、122~129位、147~149位及151~158位氨基酸可能为B淋巴细胞抗原表位,而T淋巴细胞抗原表位可能有8个。通过Western Blot试验验证,表明该蛋白与吕氏泰勒虫阳性血清有免疫反应,具有良好的抗原性。

北京市房山区羊梨形虫病流行病学调查

为了解北京郊区羊梨形虫病的流行情况，本研究采用形态学检测，同时结合使用梨形虫18S rRNA基因通用引物进行PCR与直接测序法，对来自北京市房山郊区某养殖场的120只山羊及15只绵羊全血样本进行检测。结果发现血涂片中梨形虫检测阳性率为95．0％，其中吕氏泰勒虫Theileria luwenshuni于山羊中检出115例阳性，阳性率95．8％；于绵羊中检出6只阳性；未发现其他泰勒虫以及巴贝斯虫的感染。本研究首次对北京周边地区进行羊梨形虫分子流行病学研究，发现房山地区为吕氏泰勒虫流行区，并且发现山羊对吕氏泰勒虫可呈现长期带虫感染。

基于吕氏泰勒虫4种靶基因的PCR检测方法比较

为筛选特异、敏感的吕氏泰勒虫(Theileria luwenshuni)PCR检测基因,本试验分别以吕氏泰勒虫核糖体小亚基RNA(18S rRNA)基因、主要表面蛋白(MPSP)、内转录间隔区(ITS)基因和线粒体细胞色素C氧化酶1(Cox 1)基因为靶基因进行PCR检测,并对特异性、敏感性和临床样本检出率进行对比。结果显示,4种靶基因引物均只可扩增出吕氏泰勒虫DNA,扩增不出卵形巴贝斯虫、中华泰勒虫和附红细胞体DNA,具有较好的特异性。以18S rRNA为靶基因的PCR检测方法的敏感性最高,检测量为9.82×103 copies/μL;以cox 1为靶基因的PCR检测方法的敏感性最低,检测量为9.82×105 copies/μL。在此基础上对18S rRNA基因PCR扩增引物进行筛选,引物P3具有较好的特异性和敏感性,为最佳检测引物。临床绵羊血液样本的检测结果显示,以18S rRNA为靶基因的PCR检测方法的检出率最高,为33.33%(15/45),高于MPSP、ITS基因的26.67%(12/45)和cox 1基因的22.22%(10/45)。结果表明,以18S rRNA为靶基因的吕氏泰勒虫的PCR检测方法具有较好的特异性和敏感性,可用于吕氏泰勒虫病的诊断和流行病学调查。

羊吕氏泰勒虫陕西分离株的鉴定及遗传进化分析

为了对陕西省羊血液样品中的泰勒虫（Theileria sp．）进行种类鉴定和遗传学分析，本试验利用形态学方法对采集的血液样品通过涂片和姬姆萨染色后进行显微镜观察，发现红细胞内存在大小1．0～1．5μm、原生质呈淡蓝色、染色质呈红色并处于红细胞内侧边缘的多形性虫体。利用分子生物学方法，对梨形虫主要表面蛋白（major piro—plasm surface protein，MPSP）基因进行PCR扩增、序列分析以及进化树构建，发现有2份DNA样品（TL001和TL002）扩增出大小约800bp的目的条带。序列比对和种系发育树表明，分离到的2个虫株与GenBank中neileria luwenshuni（GQ281044）序列相似性分别为100％和99％，且位于同一进化支，提示本试验所分离到羊血液原虫为吕氏泰勒虫（T．luwenshuni），同时也为该地区羊泰勒虫病的防制奠定基础。

吕氏泰勒虫TlSP基因的克隆和原核表达

为克隆表达吕氏泰勒虫TlSP基因的功能区片段并对其表达蛋白进行免疫印迹分析,以吕氏泰勒虫cDNA表达文库为模板,PCR扩增出TlSP基因片段,克隆至pET-30a载体。将成功构建的重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21trxB(DE3)pLysS,诱导表达产物用镍柱进行亲和层析纯化,并用Western-blot分析TlSP表达蛋白与尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫以及环形泰勒虫阳性血清是否产生交叉反应。结果表明,TlSP基因获得了可溶性表达蛋白,并且重组表达蛋白TlSP分别与上述3种泰勒虫阳性血清存在交叉反应。证实TlSP同源基因也存在于环形泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫,这为今后深入研究TlSP蛋白在羊泰勒虫病的免疫学诊断和亚单位疫苗研究中的作用奠定了基础。

湖南省湘西自治州黄牛泰勒虫分子流行病学调查

目的了解湖南省湘西自治州黄牛泰勒虫感染率和遗传变异。方法2018年8月至2019年8月,从湘西自治州凤凰县、花垣县和保靖县采集184份黄牛血液样品,用基于泰勒虫属18S核糖体RNA(18S r RNA)基因的PCR方法对所有血液样品进行检测。将部分阳性产物基因序列与GenBank数据库中收录的相应虫株序列进行同源性比对,以卵形疟原虫18S rRNA基因作为外群构建种系发育树。结果共143份血液样品检测为泰勒虫阳性,平均检出率为77.7%。凤凰县、花垣县和保靖县黄牛血液样品均检出泰勒虫,检出率分别为85.0%、88.3%和61.0%;湘西黄牛和普通黄牛泰勒虫检出率分别为77.2%和79.5%(χ^(2)=0.08,P>0.05);舍饲牛群与散养牛群检出率分别为68.9%和89.7%(χ^(2)=22.36,P<0.01)。随机挑选18个PCR阳性样品进行测序与序列分析,发现所有样品与已知吕氏泰勒虫分离株同源性超过99.0%;系统进化树分析发现18个样品与吕氏泰勒虫聚为同一分支,但与其他虫株所属分支相隔较远。结论湖南省湘西地区黄牛泰勒虫感染率较高,吕氏泰勒虫可能为优势虫种。

与吕氏泰勒虫TlSP蛋白互作的绵羊淋巴细胞蛋白酵母双杂交系统的筛选

为研究吕氏泰勒虫入侵绵羊淋巴细胞的机理,用绵羊外周血淋巴细胞构建酵母双杂交文库,筛选与TlSP蛋白互作的蛋白。以密度梯度离心法分离出未感染泰勒虫的绵羊淋巴细胞,TRIzol法提取总RNA,建立酵母双杂交cDNA文库。结果显示,对文库进行评定,细胞密度为1.075×109/mL,插入片段长度在250~3 000bp之间,文库滴度为1.088×108 CFU,重组率为92%。利用诱饵质粒pGBKT7-TlSP对文库进行筛选,结果筛选到9种蛋白。生物信息学分析结果显示,这些蛋白主要参与调控基因转录、mRNA翻译、细胞的增殖、分化和凋亡等过程。上述结果表明,通过酵母双杂交技术筛选出与TlSP互作的蛋白,据此推测TlSP蛋白可能与吕氏泰勒虫在绵羊淋巴细胞内的增殖相关。

吕氏泰勒虫TlSP无跨膜区重组蛋白的表达及反应原性分析

提取吕氏泰勒虫裂殖子的总RNA,采用RT-PCR方法扩增其表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein)基因的cDNA片段,结合生物信息学方法,对TlSP蛋白抗原表位和跨膜区进行预测,设计表达引物,分别扩增得到TlSP全长及逐一去除跨膜区的4个片段,并将其分别克隆至pET-30a原核表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达,并对融合蛋白的反应原性进行分析。结果表明,TlSP融合蛋白的N端具有较好的抗原性,而在C端存在3个跨膜区:185~207 aa、228~250 aa和255~277 aa;SDS-PAGE结果表明,只有去除全部跨膜区的重组载体可成功表达。Western-blot分析表明,TlSP融合蛋白能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、羊无浆体阳性血清无交叉反应。本研究为今后TlSP候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。

吕氏泰勒虫TlSP基因多态性免疫区在毕赤酵母中的高效分泌表达

为研制具有完整抗原性和天然结构的吕氏泰勒虫表面蛋白TlSP（Theileria luwenshuni surface protein）,采用RT-PCR方法从吕氏泰勒虫裂殖子总RNA反转录获得TlSP基因的c DNA序列,将其多态性免疫区域克隆至毕赤酵母表达载体p PIC9K,构建重组质粒p PIC9K-TlSP。p PIC9K-TlSP经SalⅠ酶切线性化后,电转化导入毕赤酵母菌株GS115和KM71中,经遗传霉素G-418筛选后得到高拷贝菌株,对PCR鉴定为阳性的菌株进行甲醇诱导表达。对GS115和KM71两种菌株表达重组蛋白TlSP的效果进行评估,并对TlSP的反应原性进行了分析。结果表明,反转录获得的TlSP基因的c DNA序列长为888 bp,其中多态性免疫区域长为552 bp;筛选得到抗遗传霉素G-418（4.0 mg/m L）的GS115菌株5株,KM71菌株7株,经PCR鉴定为阳性的2种菌株均成功表达了分泌型重组蛋白TlSP,GS115菌株的蛋白表达效果较好;重组蛋白TlSP能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、绵羊无浆体阳性血清无反应。本研究为深入研究TlSP蛋白在羊泰勒虫病免疫学诊断和亚单位疫苗中的应用奠定了基础。

真核表达的吕氏泰勒虫TlSP重组蛋白的免疫保护效果评价

为评价重组吕氏泰勒虫TlSP蛋白的免疫保护效果,以真核表达的不同浓度的重组TlSP抗原分别与等体积的佐剂MONTANIDE ISA 61 VG混合后充分乳化,于首次免疫后第0天和第21天分别免疫绵羊2次,于第35天进行攻蜱试验,通过观察在试验期间各组绵羊的临床症状、红细胞染虫率和特异性抗体效价等来评价免疫保护效果;空白对照组以等量PBS代替抗原进行同步参照分析。结果显示,空白对照组的绵羊出现高热、贫血和淋巴结肿胀等典型的临床症状,而2个重组蛋白免疫组只出现轻微贫血。空白对照组、免疫A组（600 g）和免疫B组（300 g）分别于攻蜱后第20天、36天和29天最早发现血液中出现泰勒虫,最高染虫率分别为8.60%、1.12%和3.00%,特异性抗体最高效价分别为1∶8 192、1∶65 536和1∶32 768。TlSP重组亚单位疫苗能刺激特异性T淋巴细胞的增殖,提高机体IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平。本研究为今后羊泰勒虫病的防治奠定了基础。