嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporusβ-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性研究

采用室内培养、测定方法,对嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus产生的β-葡萄糖苷酶进行了分离纯化及特性研究。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。结果表明,经12%SDS-PAGE测得酶的单亚基分子量约为118kDa,凝胶过滤层析测得酶的分子量约为350kDa。该酶反应的最适温度和最适pH分别为80℃和4.5￣5.0,在pH5.0条件下,该酶在70℃条件下基本稳定,80℃保温30min,剩余酶活为15%。金属离子对β-葡萄糖苷酶活性影响较大,其中Ca2+、Ba2+对酶有激活作用;Ag+、Fe3+、Cu2+对酶有显著的抑制作用。该酶对水杨苷具有很强的底物特异性。

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

采用培养分离、室内测定等方法,对嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus产生的内切β-葡聚糖酶进行了分离纯化及特性研究.粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的内切β-葡聚糖酶.结果表明,经12%SDS-PAGE测得酶的单亚基分子量约为31.5 kD,凝胶过滤层析测得酶的分子量约为34.5 kD.该酶反应的最适温度为55℃,最适pH为2.5～3.0.该酶在pH3.0条件下60℃较为稳定;80℃保温30 min有20%原酶活性.金属离子对内切β-葡聚糖酶活性影响较大,其中K+、Ca2+、Mn2+对酶有激活作用;Ag+、Cu2+、Al3+对酶有显著抑制作用.该酶对羧甲基纤维素具有很强的底物特异性.

四个嗜热真菌中国新记录种

报道四个嗜热真菌中国新记录种:嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus;埃默森篮状菌Talaromyces emersonii;杜邦青霉Penicillium dupontii及丝衣霉状拟青霉Paecilomyces byssochlamydioides,对其进行了描述和讨论。研究标本保存在山东农业大学植物病理学标本室(HSAUP)。

嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bglⅠ的全长序列,cDNA序列为2672bp,Genbank登录号为EU269025,将该片段插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K/bgl,经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,在醇氧化酶AOX1基因启动子作用下,获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株.经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组表达蛋白.SDS-PAGE测得该重组蛋白相对分子质量(Mr)约为120×103.经甲醇诱导,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达1.2U/mg,小规模发酵量达0.45mg/mL.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0.于70℃保温30min仍保持80%的酶活力,具有较高的热稳定性,在pH3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强.

嗜热真菌热稳定性β-葡萄糖苷酶的克隆表达、纯化及酶学性质

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)中克隆出β-葡萄糖苷酶基因bglII的全长序列,GenBank注册号为EU263992。将该基因插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中以获得重组质粒,将重组质粒转导入毕赤酵母中,大量筛选后获得高效表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌株。经甲醇诱导6d,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达0.23U/mg。该酶的最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃。通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组蛋白质。SDS-PAGE测得该重组蛋白质分子量约为118kDa。

嗜热子囊菌光孢变种内切葡聚糖酶I基因在毕赤酵母中的表达及部分酶学性质

嗜热子囊菌是一种嗜热真菌,可以产生具有很高工业价值的内切葡聚糖酶.本研究成功表达了嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Ⅰ基因,并获得热稳定的重组内切葡聚糖酶.提取嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)总RNA,通过RT-PCR方法克隆出内切-β-葡聚糖酶eg1基因的成熟肽编码序列.采用基因重组的方法构建该基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K-eg1,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,大量筛选后获得高效表达内切葡聚糖酶Ⅰ的毕赤酵母工程菌株GpN24.该菌株采用甲醇诱导120h后,内切葡聚糖酶Ⅰ的活力可达570.7U/mL,最适温度为55℃,在90℃的条件下保温30min后仍具有60%的酶活力;最适pH为5.0,在pH3.0～5.0的条件下酶活力保持稳定.