Thermobifida fusca海藻糖合成酶的定点突变及其动力学性质研究

对Thermobifida fusca海藻糖合成酶(TreS)保守区域的氨基酸残基I224、N242、Q333、E352和N415进行定点突变,结果表明:位点I224、N242、N415突变后酶的活力与野生型TreS相近,E352位点突变后酶的比活力提高为野生型TreS的1.25倍。突变酶的最适温度、pH、Km和Kcat没有明显变化;突变Q333R则使TreS丧失了酶活力。

褐色喜热裂孢菌Thermobifida fusca产麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以T.fusca基因组DNA为模板,PCR分别扩增不包括和包括其基因前段信号肽的产麦芽糖淀粉酶的基因片段tfa和sptfa,并克隆至表达载体pSE380上,获得重组质粒pSE380-tfa和pSE380-sptfa,以大肠杆菌JM109为宿主细胞大量表达融合蛋白,利用金属镍亲和层析对菌株JM109/pSE380-tfa表达的α-淀粉酶进行纯化,SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为64ku,K m值为1.305mg/mL,最适反应温度为60℃,最适pH为7.0;检测到菌株JM109/pSE380-sptfa的培养基上清有相当一部分酶活。本研究麦芽糖α-淀粉酶与可溶性淀粉反应,经HPLC检测产物均为麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物。因此麦芽糖α-淀粉酶在生产高麦芽糖浆上起到了一定的作用。

Thermobifida fusca麦芽三糖淀粉酶的重组表达及其在麦芽三糖制备中的应用

麦芽三糖淀粉酶以淀粉或麦芽糊精为原料,可生产麦芽三糖,在食品、饮料等行业具有广泛的应用前景。实验将Thermobifida fusca NTU22来源的麦芽三糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌WS11中进行重组表达,并进行酶学性质分析,重组酶的最适温度和pH分别是55℃和6.0。在此基础上探究了重组酶作用于麦芽糊精生产麦芽三糖的最佳条件。结果表明,以15%浓度的麦芽糊精(DE 5-7)作为底物时,酶转化的最佳条件是温度55℃、pH 5.5、加酶量60 U/g(底物)、普鲁兰酶加酶量32 U/g(底物)、反应时间11 h,此时得到麦芽三糖转化率44.4%。该研究为工业制备麦芽三糖提供了理论依据。

Thermobifida fusca海藻糖合成酶基因的克隆表达及发酵优化

将来源于嗜热单孢菌(Thermobifida fusca)的海藻糖合成酶基因进行克隆表达,构建重组菌E.coli BL 21(DE3){pET-24a(+)/Tres}。并对基因工程菌的发酵产酶条件进行优化,得到最优培养基成分为:甘油12 g/L,酵母粉24 g/L,蛋白胨12g/L,磷酸盐浓度60mmol/L,Zn2+2mmol/L。最佳培养条件为:装液量20 ml(250 ml摇瓶),发酵2 h后25℃诱导并添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG。优化后的最终发酵酶活达到28.6 U/ml,为未优化前的3.4倍,是目前国内报道大肠杆菌摇瓶发酵产海藻糖合成酶的最高表达水平,为该酶的工业化生产奠定了基础。

酿酒酵母中的嗜热细菌木糖异构酶活性表达及木糖代谢研究

将来自嗜热放线细菌Thermobif ida f usca的木糖异构酶(xylose isomerase,XI)基因xylA,连接于酵母表达载体pYES2的半乳糖诱导启动子(PGAL)下,得到重组质粒pYES2-xylA,用其转化酵母菌INVSc1,测定重组酵母菌株INVSc1-xylA的木糖异构酶活性,并对重组酵母菌株进行木糖葡萄糖共发酵试验,探讨在酿酒酵母中建立新的生产乙醇木糖代射途径。结果木糖异构酶在75℃,pH值6.8的酶活力最高,在酿酒酵母中成功地获得活性表达,并且SDS-PAGE电泳有明显的特异性表达产物带,单体分子量为43kD。INVSc1-xylA在木糖葡萄糖共发酵实验中消耗木糖和产生乙醇分别比对照菌提高53.8%和36%,提高了其生产乙醇的能力。

共表达谷氨酰-tRNA还原酶增强染料脱色过氧化物酶在大肠杆菌中的表达活性

染料脱色过氧化物酶(dye-decoloorizing peroxidase,DyP)属于以血红素为辅基的新型过氧化物酶类,常因缺乏辅因子而导致催化活性低。将来源于褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的染料脱色过氧化物酶基因(TfuDyP)与大肠杆菌谷氨酰-tRNA还原酶基因(hemA),构建重组质粒phemA-DyP,转化至E.coli BL21中进行共表达。分别以2,2-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和顽固性染料活性蓝19(RB19)、溴酚蓝、溴甲酚绿为底物检测TfuDyP的催化活力以及染料脱色效率。结果表明,诱导后的共表达菌株pAD胞内血红素含量为9. 8μmol/L,而单独过表达基因TfuDyP的菌株pD仅为3. 4μmol/L。TfuDyP纯酶的全波长扫描分析表明,在菌株pAD中DyP酶与血红素的结合度相比pD有较大幅度的提升。pAD菌株表达的DyP酶活力较pD菌株提高了110%,酶活力的提高使其在染料脱色应用方面也得到增强。在pAD菌株培养基中分别添加谷氨酸(Glu)、FeCl2使得胞内血红素含量、DyP酶活力和染料脱色效率比未添加时进一步提高。以上结果为TfuDyP的功能开发奠定了基础,同时也为其他血红素依赖性过氧化物酶的研发提供借鉴。

褐色嗜热裂孢菌脱色过氧化物酶的表达及发酵条件优化

为了提高来源于褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脱色过氧化物酶(TfuDyP)对蒽醌染料降解能力,将含有目的基因的重组质粒pET-28a(+)-TfuDyP,转化至E.coli BL21进行异源表达,并对重组TfuDyP的发酵条件进行优化,分析酶活与血红素饱和度之间的关系。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测到分子质量为46 kDa的重组TfuDyP蛋白条带。TfuDyP的最佳诱导条件为:诱导剂(IPTG)浓度0.3 mmol/L,诱导时间14 h,诱导温度30℃,在此条件下,TfuDyP比酶活达到27.9 U/g。氯高铁血红素、5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)、谷氨酸(Glu)、FeCl2、MnCl2均可提高重组TfuDyP的催化活性,酶活的提高与血红素饱和度之间存在一定的正相关性。实验结果可为利用外源添加物提高血红素的饱和度,应用于染料脱色过氧化物酶的工业发酵提供理论依据。

产几丁质酶褐色喜热裂孢菌的分离鉴定及产酶特性初步研究

采用选择性培养基从土壤中分离到1株产几丁质酶的微生物菌株YX,经形态和分子鉴定为褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)。进一步在摇瓶中比较了T.fusca YX在纤维二糖、几丁质、或羧甲基纤维素钠为碳源的培养基中的产酶特性,YX菌株在5 L发酵罐中以几丁质为碳源的培养基发酵到22 h左右时发酵液几丁质酶活即可达到1.7 U/m L。本文首次报道褐色喜热裂孢菌能够产生几丁质酶,具有潜在的应用价值。