Thermococcus siculi HJ21高温普鲁兰酶基因的克隆表达及其热稳定性保护剂研究

普鲁兰酶是水解α-1,6糖苷键的淀粉脱支酶,可提高淀粉制糖的糖化率。该研究将古菌Thermococcus siculi HJ21的超嗜热普鲁兰酶Pul-HJΔ782基因克隆在冷休克启动子cspA的质粒pColdⅠ,在宿主大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中诱导表达,研究其酶学性质,通过单因素和响应面试验优化该酶的热稳定性保护剂,并考察保护剂对酶水解马铃薯淀粉的影响。结果表明,该酶的最适作用温度和pH分别为90℃和6.5,在温度80~100℃及pH 4.0~9.0范围稳定性良好。最佳热稳定性保护剂配方为Ca^(2+)添加量0.15 mol/L、甘油添加量5.4%、Tween 20添加量3.8 mL/L、明胶添加量4.0 g/L。在该优化条件下,90℃保温12 h后,酶活保留率为97.43%,比对照组提高了34.94%。该酶的糖化率显著提高,对马铃薯淀粉糖化40 h葡萄糖当量(DE)值为58.35%,比对照组比提高了11.78%。

深海古菌Thermococcus siculi HJ21高温普鲁兰酶基因的克隆及表达

根据NCBI上公布的普鲁兰酶基因的保守序列设计简并引物,以Thermococcus siculi HJ21基因组DNA为模板进行PCR,得到T.siculi HJ21普鲁兰酶的基因,测序后通过Blast(NCBI)数据库比对和分析表明扩增基因有一个4056bp、编码1351个氨基酸的开放阅读框,为一新的普鲁兰酶基因。将该基因插入表达载体pET28a,并转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导,测定普鲁兰酶比活力。重组转化子的细胞破碎液有高温普鲁兰酶活性,SDS-PAGE电泳结果显示出分子质量约为150kD的特异性条带。

超嗜热古菌Thermococcus sp．HJ21产高温α-葡萄糖苷酶条件和酶学性质初步研究

对1株分离自深海热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp.HJ21)菌株进行了产α-葡萄糖苷酶条件的优化和酶学性质的初步研究。结果表明,该菌株发酵时间为6h时,较适合产胞内α-葡萄糖苷酶,发酵时间为21 h时较适合产胞外α-葡萄糖苷酶。其最适产酶温度为85℃,pH为6.5,NaCl浓度为2.5%。可溶性淀粉、酵母粉和蛋白胨促进产酶。该酶的最适作用温度为100℃,90℃半衰期(t_(1/2))为2h。最适酶作用pH值为7.0,在pH值5.0～8.0酶活力相对稳定。金属离子Cu^(2+)、Al^(3+)、Ni^(2+)对该酶有较明显抑制作用,Hg^(2+)几乎完全抑制该酶的活性,而EDTA、Fe^(3+)和K^+对该酶有激活作用。

合成嗜热酸性淀粉酶的毕赤酵母表达

把密码子优化后的超耐热酸性α-淀粉酶的基因BD5088,引入载体pPIC9K中,将正确构建的重组质粒pPIC9K-BD5088转化毕赤酵母GS115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,重组超耐热酸性α-淀粉酶PrBD5088在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外。该酶受甲醇的严格调控和诱导,在诱导培养5 d后酶活力达到最大值,表达量可达到约200 mg/L。与原核表达产物ErBD5088相比,PrBD5088的酶学性质发生了一定的改变。其最适反应温度由80℃增加到90℃。最适反应pH值仍为pH5.6,但范围更宽,在pH值5.0～6.5之间,其相对酶活在90%以上,在pH4.0～8.0范围内酶活性保留50%以上。而ErBD5088则只在pH5.0～7.0范围内能维持活性的50%以上。且PrBD5088的温度稳定性远高于ErBD5088。PrBD5088在100℃条件下热处理1 h仍具有80%以上的酶活力,而ErBD5088相同条件下的半衰期只有20 min。此外,Ca2+和Zn2+对维持rBD5088活性和稳定性会产生轻微促进作用,该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。SDS-PAGE测得该酶的分子量为56 ku,高于原核表达的酶蛋白。重组α-淀粉酶PrBD5088不存在N-连接的糖基化,但是存在O-连接的糖基化现象。本实验结果表明O-连接糖基化可适当提高PrBD5088的热稳定性、最适温度和酸性pH条件下酶活性。

超嗜热古菌遗传操作系统研究进展

遗传操作系统,是研究基因和基因产物功能的一个极为重要的工具。超嗜热古菌遗传操作系统方面的研究落后于甲烷菌及嗜盐古菌中的研究,主要原因是选择标记的缺乏。然而,近十年来,在以硫化叶菌(Sulfolobus)为代表的超嗜热泉古菌和Thermococcus kodakaraensis为代表的超嗜热广古菌中,遗传操作系统研究取得了很大的进展。本文主要对这两种超嗜热古菌的遗传操作系统进展以及应用进行概述。