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超嗜热细菌Thermotoga maritima酯酶Tm1350克隆、表达及其酶学性质研究 被引量:1
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作者 魏涛 杜聪聪 +1 位作者 毛多斌 马歌丽 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期179-183,共5页
以超嗜热细菌Thermotoga maritima基因组DNA为模板,通过PCR法扩增酯酶Tm1350基因,构建重组质粒p ET15b-Tm1350,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中实现表达,并采用p-NPA方法测定其酶活性。研究结果表明,酯酶Tm1350可以水解不同碳... 以超嗜热细菌Thermotoga maritima基因组DNA为模板,通过PCR法扩增酯酶Tm1350基因,构建重组质粒p ET15b-Tm1350,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中实现表达,并采用p-NPA方法测定其酶活性。研究结果表明,酯酶Tm1350可以水解不同碳链长度(10C)的对硝基苯酚酯,其中对硝基苯酚戊酸酯(p NP-C5)是该酶最适合底物;该酶最适反应温度和p H分别为70℃和6.5,90℃处理5h,仍有50%以上的酶活力,具有较强的热稳定性。酯酶Tm1350对金属离子、抑制剂、变性剂和有机溶剂具有较强的抗性。 展开更多
关键词 thermotoga maritima 酯酶 克隆表达 酶学性质
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Cloning and Expression of Extremely Heat-Resistant Endo-β-1,4-Glucanase Gene from Thermotoga maritima in Bacillus subtilis
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作者 郝亚荣 陈婷 张兴群 《Journal of Donghua University(English Edition)》 EI CAS 2019年第5期479-482,共4页
Gene encoding endo-β-1,4-glucanase(TM1525)is derived from Thermotoga maritima(T.maritima),which has an open reading frame of 825 bp and encodes a 274 amino acid endo-β-1,4-glucanase.This enzyme has the same high tem... Gene encoding endo-β-1,4-glucanase(TM1525)is derived from Thermotoga maritima(T.maritima),which has an open reading frame of 825 bp and encodes a 274 amino acid endo-β-1,4-glucanase.This enzyme has the same high temperature resistance as thermophilic bacteria,which is an ideal property for industrial applications.By molecular biological means,TM1525 was cloned into pHT43 vector and introduced into Bacillus subtilis(B.subtilis)WB800N by electroporation.The results showed that the WB800N expression system was successfully constructed,and extracellular expression of the recombinant gene was achieved.Cellulose hydrolyzed activity of the protein was exhibited. 展开更多
关键词 endo-β-1 4-glucanase pHT43 BACILLUS SUBTILIS WB800N thermotoga maritima
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海栖热袍菌耐高温β-半乳糖苷酶基因的克隆和表达 被引量:6
3
作者 张敏 江正强 +2 位作者 唐荦 丛倩千 李里特 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期507-511,共5页
本文主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的一个β-半乳糖苷酶基因(TM_0310)。以海栖热袍菌基因组DNA(GenBank登录号AE000512)为模板,设计特异性引物带有NcoI-HindIII酶切位点,克隆得到的该基因全序列... 本文主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的一个β-半乳糖苷酶基因(TM_0310)。以海栖热袍菌基因组DNA(GenBank登录号AE000512)为模板,设计特异性引物带有NcoI-HindIII酶切位点,克隆得到的该基因全序列为2019bp,编码672个氨基酸,分子量为78.972kD。该基因编码的蛋白质属于42族,根据氨基酸同源性分析,该β-半乳糖苷酶与Thermotoga petrophila RKU-1来源的假想的β-半乳糖苷酶(GenBank登录号ABQ46628.1)以及Thermotoga sp.RQ2来源的β-半乳糖苷酶(GenBank登录号EDQ29256.1)同源性最高,均为95%。重组转化子经诱导酶比活可达2.08U/mg蛋白。粗酶液经过80℃热处理10min,酶活残留70%以上,表明该酶有很好的耐热性,在高温工业环境中有良好应用前景。 展开更多
关键词 海栖热袍菌 Β-半乳糖苷酶 克隆 表达 高温
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枯草芽孢杆菌分泌表达极耐热木聚糖酶及其酶学性质 被引量:9
4
作者 向亚萍 罗楚平 +2 位作者 周华飞 刘永锋 陈志谊 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第5期1037-1042,共6页
为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B(Gen Bank登录号AY340789)在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,... 为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B(Gen Bank登录号AY340789)在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,将其转化到枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组枯草芽孢杆菌(Bs916/p XYNB2),并对重组芽孢杆菌分泌表达的极耐热木聚糖酶的酶学性质进行了研究。SDS-PAGE法测定重组枯草芽孢杆菌分泌的蛋白在相对分子质量43 000处有明显的蛋白表达条带。重组木聚糖酶的最适反应p H值为5.0-5.8,重组木聚糖酶的最适反应温度大于或等于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.6-7.8比较稳定,重组木聚糖酶的温度稳定性在90℃下保温2 h后残存酶活83%。可见,生防枯草芽孢杆菌Bs916能有效分泌表达极耐热木聚糖酶,为以后构建多种纤维素和半纤维素在其中的协同表达,拓宽其碳源利用范围奠定基础。 展开更多
关键词 重组枯草芽孢杆菌 海栖热袍菌 极耐热木聚糖酶 基因融合 分泌表达
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利用固定化耐高温木聚糖酶生产木二糖 被引量:5
5
作者 江正强 陈思思 +2 位作者 李道义 朱运平 李里特 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第10期365-368,共4页
将重组海栖热袍菌(Thermotoga maritima)极耐热木聚糖酶B固定于镍螯合环氧载体Eupergit C 250L(固定化XynB)上,水解玉米芯汽爆液连续生产低聚木糖,特别是木二糖。固定化XynB操作稳定性很高,批次水解15次仍保持92%的初始水解活性。90℃... 将重组海栖热袍菌(Thermotoga maritima)极耐热木聚糖酶B固定于镍螯合环氧载体Eupergit C 250L(固定化XynB)上,水解玉米芯汽爆液连续生产低聚木糖,特别是木二糖。固定化XynB操作稳定性很高,批次水解15次仍保持92%的初始水解活性。90℃下连续水解168h后保持83.6%的初始水解活性,连续操作半衰期为577.6h(24d)。HPLC分析表明,连续水解液中主要含有49.8%木二糖和22.6%木糖。活性碳层析柱可吸附木二糖,利用乙醇梯度洗脱木二糖的收率为84.7%,纯度为97.2%。因此,固定化XynB可用于水解玉米芯汽爆液高效生产木二糖。 展开更多
关键词 活性碳层析 固定化 海栖热袍菌 木聚糖酶 木二糖
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烷基木糖苷的酶法合成及其纯化 被引量:4
6
作者 朱运平 江正强 +2 位作者 李里特 李道义 沈颖桀 《过程工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2004年第6期572-576,共5页
用海栖热袍菌的极耐高温木聚糖酶B(XynB)水解木聚糖,通过转糖苷化反应合成了β-(1,4)烷基木单苷和木二苷.XynB能够水解对硝基木单苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, pNP-X)和对硝基木二苷(p-nitrophenyl-β-D-xylobioside, pNP-X2)... 用海栖热袍菌的极耐高温木聚糖酶B(XynB)水解木聚糖,通过转糖苷化反应合成了β-(1,4)烷基木单苷和木二苷.XynB能够水解对硝基木单苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, pNP-X)和对硝基木二苷(p-nitrophenyl-β-D-xylobioside, pNP-X2),同时以不同长度碳链(C1-C4)的醇及其异构醇和二级结构醇作为转糖苷化反应的受体,生成烷基木单苷和木二苷.另外XynB还可以水解天然木聚糖,同时合成产量很高的烷基木单苷和烷基木二苷.反应生成物采用活性碳层析柱进行分离纯化,用40-的乙醇梯度洗脱,洗脱液流速为1.5 mL/min,得到纯的β-(1,4)烷基木单苷和木二苷. 展开更多
关键词 酶法合成 烷基木单苷 烷基木二苷 转糖苷化反应 耐高温木聚糖酶 海栖热袍菌
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极耐高温木聚糖酶的Eudragit S-100固定化及其对不同纸浆的助漂作用 被引量:4
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作者 李里特 朱运平 +2 位作者 江正强 艾志录 李秀婷 《中国造纸》 CAS 北大核心 2005年第7期1-5,共5页
以溶解性可以通过pH值进行调节的EudragitS 1 0 0为载体,对海栖热袍菌的极耐高温木聚糖酶B(XynB)进行固定化,并对固定化酶的性质进行了测定,初步研究了固定化酶对浆料的助漂效果。结果表明,XynB经固定化后,酶活回收率高达90 % ,且对原... 以溶解性可以通过pH值进行调节的EudragitS 1 0 0为载体,对海栖热袍菌的极耐高温木聚糖酶B(XynB)进行固定化,并对固定化酶的性质进行了测定,初步研究了固定化酶对浆料的助漂效果。结果表明,XynB经固定化后,酶活回收率高达90 % ,且对原酶有纯化作用,固定化酶达到电泳单一带的纯度。固定化酶与游离酶相比,最适温度提高了5℃,达95℃,温度稳定性也有较大提高。可溶性固定化酶能有效作用于不溶底物,纸浆经固定化酶处理后释放出大量的还原糖,浆料卡伯值均有不同程度降低,表明固定化酶应用于纸浆助漂有很大潜力。 展开更多
关键词 耐高温木聚糖酶 海栖热袍菌 固定化 纸浆预漂 EUDRAGIT S-100
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极端嗜热菌海栖热袍菌α-葡萄糖醛酸酶的高效表达和重组酶的纯化 被引量:5
8
作者 薛业敏 毛忠贵 邵蔚蓝 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期554-560,共7页
α 葡萄糖醛酸酶作为木聚糖降解的限速酶之一 ,在木聚糖类半纤维素的生物转化中起着重要的作用。海栖热袍菌Thermotogamaritima是一个嗜极端高温的厌氧细菌 ,其产生的极耐热性酶类具有非常可观的工业应用前景。但热袍菌属Thermotoga的... α 葡萄糖醛酸酶作为木聚糖降解的限速酶之一 ,在木聚糖类半纤维素的生物转化中起着重要的作用。海栖热袍菌Thermotogamaritima是一个嗜极端高温的厌氧细菌 ,其产生的极耐热性酶类具有非常可观的工业应用前景。但热袍菌属Thermotoga的基因在大肠杆菌中的表达一般较困难。研究了T .maritima中的极耐热性α 葡萄糖醛酸酶基因在大肠杆菌不同菌株中的表达水平及纯化技术。结果表明 ,稀有密码子AGA、AGG和AUA限制了该基因在大肠杆菌中的表达 ,在大肠杆菌BL2 1 CodonPlus(DE3) RIL可得到高效表达 ,重组蛋白表达量达 2 0 % ,比酶活比野生菌株提高 5倍 ;重组蛋白经热处理和金属Ni2 + 的亲和层析提纯后 ,达到了电泳纯 ,提纯倍数为 5 1倍 ,收率为5 5 1 %。对重组菌诱导表达条件的研究表明 ,营养丰富的TB培养基有助于重组菌的生长 ,重组菌生长至OD6 0 0 为0 7~ 0 8时添加IPTG诱导 展开更多
关键词 海栖热袍菌 α-葡萄糖醛酸酶 高效表达 重组酶纯化 酶学性质
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极端嗜热菌海栖热袍菌木聚糖酶B的克隆和表达 被引量:8
9
作者 江正强 李里特 +1 位作者 林清 MOHAMMAD Mainul Ahsan 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 2002年第3期280-284,共5页
极端嗜热菌海栖热袍菌MSB8(ThermotogamaritimaMSB8)能够利用木聚糖代谢 ,并具有两个产木聚糖酶的基因 .本研究首次克隆和在大肠杆菌中表达海栖热袍菌MSB8的第 2个木聚糖酶基因即xynB基因 .以基因组DNA为模板 ,根据xynB基因的全序列设... 极端嗜热菌海栖热袍菌MSB8(ThermotogamaritimaMSB8)能够利用木聚糖代谢 ,并具有两个产木聚糖酶的基因 .本研究首次克隆和在大肠杆菌中表达海栖热袍菌MSB8的第 2个木聚糖酶基因即xynB基因 .以基因组DNA为模板 ,根据xynB基因的全序列设计了两对引物 ,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB基因片段 .选用pET2 8a(+)表达载体 ,NcoI-HindⅢ酶切位点并编码了羧基端 6×His标签的阳性克隆表达成可溶且具有生物活性的蛋白质 .xynB结构基因由 10 4 4对碱基组成 ,编码 347个氨基酸 .根据已知木聚糖酶蛋白质氨基酸的同源性分析 ,XynB与T .sp.strainFjSS3-B .1的XynA的同源性最大 ,为 85 % ,与T .neapolitana的XynB同源性次之 ,为 82 % ,与其它木聚糖酶的同源性小于 4 3% .另外 ,XynB属于F/ 10族木聚糖酶 ,且含有单一功能区 .表 3图 3参 展开更多
关键词 极端嗜热菌 海栖热泡袍菌 木聚糖酶B 克隆 表达
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海栖热袍菌耐高温β-甘露糖苷酶基因的克隆及表达 被引量:2
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作者 张敏 关国华 +2 位作者 江正强 李颖 李里特 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期365-368,共4页
以海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8基因组DNA为模板,克隆得到β-甘露糖苷酶基因(man2).测序分析表明,该基因全序列为2358bp,编码785个氨基酸,分子量约为92×103.根据蛋白质氨基酸的同源性分析,该β-甘露糖苷酶与新阿波罗栖热袍... 以海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8基因组DNA为模板,克隆得到β-甘露糖苷酶基因(man2).测序分析表明,该基因全序列为2358bp,编码785个氨基酸,分子量约为92×103.根据蛋白质氨基酸的同源性分析,该β-甘露糖苷酶与新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)Man2(accession No.AAK52304.1)的同源性最大,达到80%.将此基因连接至表达载体pET-28a(+)并转化到大肠杆菌BL21细胞中,经IPTG诱导,β-甘露糖苷酶活力达5.96U/mL.粗酶的温度稳定性分析表明,该酶的热稳定性好,90℃处理10min,活力回收率65%,具有重要的工业应用前景. 展开更多
关键词 耐高温β-甘露糖苷酶 海栖热袍菌 重组蛋白 表达
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海栖热袍菌极端耐热木聚糖酶B的提纯 被引量:8
11
作者 江正强 李里特 +1 位作者 林清 Mohammad Mainul Ahsan 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期32-37,共6页
克隆并在大肠杆菌中表达的海栖热袍菌的 xyn B基因 ,其表达产物木聚糖酶 B的 C 末端带有 6×His标签 ,研究了这种基因重组酶的提纯方法。通过对粗酶提取液的热变性处理 ,Ni NTA亲和柱层析和离子柱层析 ,最终得到了电泳纯的木聚糖酶... 克隆并在大肠杆菌中表达的海栖热袍菌的 xyn B基因 ,其表达产物木聚糖酶 B的 C 末端带有 6×His标签 ,研究了这种基因重组酶的提纯方法。通过对粗酶提取液的热变性处理 ,Ni NTA亲和柱层析和离子柱层析 ,最终得到了电泳纯的木聚糖酶 B,提纯倍数 4 4.4 ,得率 11。SDS PAGE法测定木聚糖酶 B的相对分子质量为 4 2 ku,与理论推算值 4 2 展开更多
关键词 海栖热袍菌 耐热木聚糖酶B 热处理 离子交换柱层析 提纯
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重组海栖热袍菌极耐热甘露聚糖酶的纯化和性质研究 被引量:3
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作者 张敏 江正强 李里特 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1565-1571,共7页
研究了海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8甘露聚糖酶基因(TM_1227)的克隆、重组酶的纯化和性质。该基因全序列2010bp,编码669个氨基酸,分子量为76.827kD。根据氨基酸同源性分析,该β-甘露聚糖酶与Thermotogasp.RQ2来源的β-甘露聚糖... 研究了海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8甘露聚糖酶基因(TM_1227)的克隆、重组酶的纯化和性质。该基因全序列2010bp,编码669个氨基酸,分子量为76.827kD。根据氨基酸同源性分析,该β-甘露聚糖酶与Thermotogasp.RQ2来源的β-甘露聚糖酶(GenBank登录号ACB09927.1)同源性最高,为99%。重组转化子经IPTG诱导酶比活可达39.7U/mg蛋白。粗酶液经金属亲和层析,得到电泳纯甘露聚糖酶。以槐豆胶为底物时,该酶的最适反应温度和pH分别为95°C和pH8.0,85°C处理30min酶活保存50%以上,很有潜力用于高温、偏碱性的造纸工业。对椰子甘露聚糖和槐豆胶的主要水解产物是不同聚合度的甘露寡糖,几乎没有单糖生成,适合生产低聚甘露糖。 展开更多
关键词 海栖热袍菌 甘露聚糖酶 表达 高温酶
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乳糖诱导极耐高温木聚糖酶基因B在大肠杆菌中的表达 被引量:2
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作者 朱运平 江正强 李里特 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期37-41,共5页
以融合极耐高温木聚糖酶基因B(XynB)的大肠杆菌(E coli)BL2 1(DE3)为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间、诱导培养温度及初始pH对目标蛋... 以融合极耐高温木聚糖酶基因B(XynB)的大肠杆菌(E coli)BL2 1(DE3)为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间、诱导培养温度及初始pH对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,IPTG诱导时酶活力达到16 18U/ 10 0mL。乳糖诱导的最优发酵条件为:初始培养基pH 7 0 ,当OD60 0 为2 5时加入0 5 %的乳糖,在37℃条件下诱导培养10h ,收获时OD60 0 达3 5 5 ,酶活力为2 5 91U/ 10 0mL。 展开更多
关键词 木聚糖酶基因 大肠杆菌 耐高温 乳糖 IPTG 发酵条件 表达规律 培养时间 蛋白表达 培养温度 诱导培养 诱导剂 酶活力 培养基
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海栖热袍菌电转化技术的研究
14
作者 彭静静 蒋钰瑶 +2 位作者 周庆 王未未 邵蔚蓝 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第29期17764-17766,17777,共4页
[目的]对海栖热袍菌电转化技术进行研究。[方法]采用不同参数即不同的方型电脉冲参数、指数衰退型电脉冲参数和高电压电击参数对海栖热袍菌感受态细胞进行电转化,得到的转化子进行PCR验证。[结果]试验中发现以150 V的低压方形电脉冲,室... [目的]对海栖热袍菌电转化技术进行研究。[方法]采用不同参数即不同的方型电脉冲参数、指数衰退型电脉冲参数和高电压电击参数对海栖热袍菌感受态细胞进行电转化,得到的转化子进行PCR验证。[结果]试验中发现以150 V的低压方形电脉冲,室温厌氧条件下电击25 ms、1次,有利于T.maritima MS8的转化,但这种以整合质粒进行的转化效率极低。[结论]为提高T.maritima MS8的基因转化效率奠定了基础。 展开更多
关键词 海栖热袍菌 整合质粒 电转化 方型电脉冲
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海栖热袍菌电转化技术的研究(英文)
15
作者 彭静静 周庆 +1 位作者 蒋钰瑶 邵蔚蓝 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2011年第10期1413-1416,共4页
[目的]对海栖热袍菌电转化技术进行研究。[方法]采用不同参数即不同的方型电脉冲参数、指数衰退型电脉冲参数和高电压电击参数对海栖热袍菌感受态细胞进行电转化,得到的转化子进行PCR验证。[结果]试验中发现以150V的低压方形电脉冲,室... [目的]对海栖热袍菌电转化技术进行研究。[方法]采用不同参数即不同的方型电脉冲参数、指数衰退型电脉冲参数和高电压电击参数对海栖热袍菌感受态细胞进行电转化,得到的转化子进行PCR验证。[结果]试验中发现以150V的低压方形电脉冲,室温厌氧条件下电击25ms、1次,有利于T.maritima MS8的转化,但这种以整合质粒进行的转化效率极低。[结论]为提高T.maritima MS8的基因转化效率奠定了基础。 展开更多
关键词 海栖热袍菌 整合质粒 电转化 方型电脉冲
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重组极耐热木聚糖酶和重组极耐热漆酶协同漂白麦草浆
16
作者 郑志强 李华钟 邵蔚蓝 《工业微生物》 CAS CSCD 2014年第3期1-6,共6页
利用来自海栖热袍茵的重组极耐热木聚糖酶XynB和来自嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27的重组极耐热漆酶Tth-laccase对麦草浆进行协同漂白。结果表明,当未漂浆经XL漂序处理(X:重组木聚糖酶用量20 U/g绝干浆,pH 5.8,温度90℃,浆浓8%,... 利用来自海栖热袍茵的重组极耐热木聚糖酶XynB和来自嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27的重组极耐热漆酶Tth-laccase对麦草浆进行协同漂白。结果表明,当未漂浆经XL漂序处理(X:重组木聚糖酶用量20 U/g绝干浆,pH 5.8,温度90℃,浆浓8%,处理时间2 h;L:重组漆酶用量3 U/g绝干浆,pH 4.5,温度90℃,浆浓8%,处理时间1.5 h),可获得最佳漂白效果。与对照浆比较,XL处理使浆料白度提升11.5%ISO,卡伯值降低6.9。双酶协同处理在改善浆料可漂性的同时,对纸浆纤维强度无负面影响。在后续过氧化氢漂白段中,当漂终白度相近时,XL预处理浆可节省约50%H_2O_2消耗量。 展开更多
关键词 木聚糖酶 漆酶 麦草浆 漂白 海栖热袍菌 嗜热栖热菌
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海栖热袍菌极耐高温木聚糖酶B的化学修饰和活性中心 被引量:6
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作者 余小红 李里特 +1 位作者 江正强 李秀婷 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 2004年第3期349-353,共5页
分别用NBS、DTNB、Phenylgloxal、PMSF、WRK等对海栖热袍菌极耐高温木聚糖酶B进行化学修饰 .结果表明 ,酶蛋白分子上的色氨酸和谷氨酸 (或天冬氨酸 )残基是维持酶活性的必需基团 .半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸及组氨酸残基均不处于酶活性中... 分别用NBS、DTNB、Phenylgloxal、PMSF、WRK等对海栖热袍菌极耐高温木聚糖酶B进行化学修饰 .结果表明 ,酶蛋白分子上的色氨酸和谷氨酸 (或天冬氨酸 )残基是维持酶活性的必需基团 .半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸及组氨酸残基均不处于酶活性中心 .而修饰酶热稳定性测定结果是 ,羧基对稳定性起重要作用 .通过测定修饰酶的假一级常数 ,得到一个色氨酸残基和一个谷氨酸 (或天冬氨酸 )残基为极耐高温木聚糖酶B所必需 .在加入少量底物后 ,极耐高温木聚糖酶B的最大荧光发射峰从天然状态下的 336nm处红移至 345nm ,且峰强度下降 .这表明色氨酸残基位于酶蛋白表面 .图 7表 2参 展开更多
关键词 海栖热袍菌 极耐高温木聚糖酶B 化学修饰 活性中心
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海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E·coli中的高效表达 被引量:3
18
作者 王希菊 蒋宇 邵蔚蓝 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期25-30,共6页
为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌(Therm otoga maritima)基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20(b... 为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌(Therm otoga maritima)基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20(b)中构建成质粒pET-amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyAⅠ基因插入pET-20(b)中构建成质粒pET-amyAⅠ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET-amyAⅠ中构建成质粒pET-amyAⅡ。将重组质粒分别转化到E.coliJM109(DE3),并将重组质粒pET-amyAⅠ转化E.coliBL21-CodonP lus(DE3)-R IL。通过IPTG诱导测酶活性:在E.coliJM109(DE3)中表达的重组酶(pET-amyA)、(pET-amyAⅠ)、(pET-amyAⅡ)的酶活分别是1658.0 U/mL、6721.7 U/mL、8904.5 U/mL,在E.coliBL21-CodonP lus(DE3)-R IL中表达的重组酶(pET-amyAⅠ)的酶活是13867.7 U/mL。表明通过这些手段能大幅提高T.maritima胞外α-淀粉酶在E.coli中的表达水平。 展开更多
关键词 海栖热袍菌 Α-淀粉酶 argU基因 高效表达
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海栖热袍菌木聚糖酶B的分子改造、高效表达及其在啤酒中的应用 被引量:6
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作者 刘学强 江正强 +3 位作者 余静 马俊文 杨行 闫巧娟 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第6期66-73,共8页
研究海栖热袍菌木聚糖酶B(TmXynB)的定向进化、高效表达和应用。构建突变文库后经两轮筛选,获得一个在酸性高温下具有高比活力的突变体(mTmXynB)。突变体mTmXynB的最适pH值和最适温度为5.5和90℃,较野生型的最适pH值和最适温度分别下降... 研究海栖热袍菌木聚糖酶B(TmXynB)的定向进化、高效表达和应用。构建突变文库后经两轮筛选,获得一个在酸性高温下具有高比活力的突变体(mTmXynB)。突变体mTmXynB的最适pH值和最适温度为5.5和90℃,较野生型的最适pH值和最适温度分别下降了0.5和10℃,对小麦阿拉伯木聚糖的比活力由529 U/mg提高至1565 U/mg。序列比对表明,mTmXynB中3个氨基酸发生突变,分别为Asn91Ser、Trp129Arg和Arg143Glu。经定点突变实验,Arg143Glu通过改变局部蛋白表面的电荷分布提高了其耐酸性,Trp129Arg通过打破疏水平台降低了酶的最适温度,而Asn91Ser可能通过改变底物结合位点Trp89的构象提高该酶的催化活力。进一步将mTmXynB表达至毕赤酵母,经高密度发酵酶活力达18000 U/mL。突变体mTmXynB和野生型TmXynB分别添加至麦芽糖化过程中,结果表明mTmXynB在150 U/g麦芽添加量时效果最好,可降低45%的过滤时间和8.7%的料液黏度。而TmXynB在600 U/g麦芽添加量时效果最好,分别降低39%和8.1%的过滤速度和料液黏度。因此,突变体mTmXynB在啤酒工业中具有很好的应用前景。 展开更多
关键词 木聚糖酶B 海栖热袍菌 定向进化 高效表达 麦芽糖化
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海栖热袍菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆、表达及酶学性质 被引量:1
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作者 王一帆 裴建军 +2 位作者 邵蔚蓝 段作营 李华钟 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1587-1592,共6页
海栖热袍菌(Thermotoga maritima)是嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的葡萄糖异构酶由于其出色的耐热性有着潜在的工业应用价值。由于海栖热袍菌苛刻的培养条件导致其葡萄糖异构酶产量较低。通过PCR方法克隆编码zmaritimaMSB8葡萄糖异... 海栖热袍菌(Thermotoga maritima)是嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的葡萄糖异构酶由于其出色的耐热性有着潜在的工业应用价值。由于海栖热袍菌苛刻的培养条件导致其葡萄糖异构酶产量较低。通过PCR方法克隆编码zmaritimaMSB8葡萄糖异构酶基因xylA,构建重组质粒pHsh—xylA,转入EscherichiacoliJMl09,通过热激诱导表达。通过热处理和离子交换层析纯化两步得到电泳纯的酶制品,纯化倍数和回收率分别为8.02和49.02。对酶学性质研究表明,该重组酶为金属离子激活性酶,Mg^2+,Co^2+对相对酶活有很强的激活作用,其最适pH为7.0,最适反应温度为95℃,且在pH6-8之间有着较好的稳定性,在95℃下半衰期长达5h以上。以葡萄糖为底物时的表观Km和Kmax、分别为105mmol/L和45.2mol/min·mg。 展开更多
关键词 葡萄糖异构酶 海栖热袍菌 表达 酶学性质
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