杨树桑黄6-磷酸海藻糖合成酶基因克隆鉴定与表达分析

对杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)6-磷酸海藻糖合成酶基因(SvTPS)进行克隆和生物信息学分析,并进行原核表达;采用荧光定量PCR方法研究SvTPS在杨树桑黄菌丝体和不同年份子实体中的表达情况,测定菌丝体和不同年份子实体中SvTPS活性。结果表明:SvTPS DNA序列长度为1894 bp,编码576个氨基酸。SvTPS相对分子质量为65130,等电点为6.21,脂肪系数为88.14,平均亲水系数为-0.281,不稳定系数为42.41。SvTPS氨基酸序列与暴马桑黄(S.baumii)的相似性最高,仅有一个TPS单结构域;SvTPS二级结构中α-螺旋、β-折叠、延伸链、无规卷曲占比分别为48.61%、5.56%、15.62%、30.21%。三年生子实体SvTPS的表达量最高,菌丝体的表达量最低。菌丝体的SvTPS活性最低;随着栽培时间增加,SvTPS活性增加,三年生子实体的最高。研究结果为进一步探讨SvTPS在杨树桑黄生长发育过程中的功能提供参考。

穿心莲海藻糖-6-磷酸合酶1(ApTPS1)生物信息学与表达分析

以穿心莲(Andrographis paniculata)为材料,基于全长转录组数据,筛选和克隆穿心莲海藻糖-6-磷酸合酶1基因(命名为ApTPS1)。生物信息学分析显示,ApTPS1基因的开放阅读框长度为2787 bp,编码928个氨基酸,分子质量为105178.82 u,理论等电点为6.67,为亲水蛋白,无信号肽。多重序列比对显示,ApTPS1较为保守,系统进化树分析表明该蛋白与凤梨亲缘关系最近,与拟南芥和烟草亲缘关系相对较远。利用实时荧光定量PCR分析穿心莲不同生态型、不同器官以及不同光周期条件下ApTPS1基因的表达特性,结果表明,早花生态型穿心莲的ApTPS1表达水平高于晚花生态型,且这种关系不受光周期的影响;ApTPS1在穿心莲的不同器官中的表达水平依次为花>果实>花蕾≈新叶≈老叶。以上结果说明,ApTPS1可能与穿心莲开花时间及生殖器官发育有密切关系。ApTPS1基因的克隆及差异表达分析为穿心莲开花期调控及优良品种的选育提供了理论基础。

芝田硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ 方法从芝田硫化叶菌中扩增了编码一种新酶，即麦芽寡糖基海藻糖合酶（ ＭＴＳａｓｅ） 的基因，扩增的２－２ｋｂ ＤＮＡ 插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０ 中，构建成重组质粒ｐＳＢＧＴ１ 。ｐＳＢＧＴ１ 中ＭＴＳａｓｅ 基因在大肠杆菌中得到表达。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物ＭＴＳａｓｅ蛋白的分子量约为７４ｋＤａ ，同核苷酸序列测定所推导的值相符。表达产物占细胞总蛋白约４－４ ％ 。ｐＳＢＧＴ１ 产生的重组酶作用于淀粉部分水解物，使ＤＥ 值降低，得到非还原糖或低还原糖。

海藻糖-6-磷酸合成酶转基因烟草提高耐盐性的研究

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-pho sphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶,近些年来受到广泛关注,以往的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物体内TPS基因的研究较少。为此,我们首先通过RT-PCR(reverse tran-scription PCR)克隆得到了拟南芥的TPS基因,进而将其构建到原核高效表达载体pET30a(+)上并在大肠杆菌BL21中进行高效诱导表达。在确认该基因能够在体外正常表达之后,将其构建到植物表达载体上并转入烟草体内,通过实时荧光定量PCR检测,证明在转基因个体中目的基因已经在受体基因组上完成整合,并且在其中的2个个体中实现了正常转录。在对目标个体进行海藻糖含量的测定以及抗逆性实验后发现,S5个体具有良好的表现,其体内海藻糖的含量明显高于其它个体,并具有较强的耐受盐胁迫的能力。

嗜热栖热菌海藻糖合酶的分子改造及其应用

对前期获得的Thermus thermophilus海藻糖合酶进行了分子改造以提升其催化制备海藻糖的性能。利用定点突变技术,将第251位Pro突变为Leu,得到突变体P251L,并于E.coli BL21(DE3)中重组表达,重组菌在摇瓶中发酵酶活为6.9 U/m L。以突变体催化制备海藻糖的研究表明,当以0.3 g/m L麦芽糖为底物,初始反应p H为7.5,温度为50℃,加酶量为20 U/g麦芽糖时,转化率达到最高值62.0%,比天然酶高出13.0%。

水生栖热菌FL-03海藻糖合酶基因的克隆及真核表达

通过基因工程技术合成海藻糖合酶Tres全基因,插入到毕赤酵母菌表达载体pPICZα中。电转化毕赤酵母菌GS115后,经Zeocin抗性筛选阳性菌株。用PCR和全基因测序鉴定目的基因的表达。通过诱导表达目的蛋白,并以SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。成功地构建了pPICZα-Tres重组质粒,并证明目的基因已整合于毕赤酵母菌的基因组。

酿酒酵母海藻糖-6-磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株AS2 1 41 6中分离纯化出总RNA和mRNA ,以AMV逆转录酶合成cDNA ,采用保守引物 ,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因 ,对该基因的全序列分析表明 ,该基因含有 1 50 7个核苷酸 ,与国外报道相关基因的同源性达 99 6%。利用BamHⅠ和SacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体 pBin438多克隆位点上 ,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。

德国小蠊两个海藻糖合成酶基因的克隆、组织分布及温度诱导表达分析

【目的】海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是参与昆虫血糖-海藻糖合成的关键酶。本研究旨在克隆德国小蠊Blattella germanica TPS基因,研究TPS基因在德国小蠊不同组织中的表达模式及在不同温度处理下的表达情况。【方法】通过RACE技术克隆德国小蠊TPS基因全长序列,利用荧光定量PCR的方法检测TPS基因在德国小蠊5龄幼虫不同组织中的表达模式及在高温(40℃和46℃处理30 min)及低温(0℃和10℃处理1 h)逆境下的表达量变化。【结果】从德国小蠊中克隆获得2个TPS基因,分别命名为Bg TPS1(Gen Bank登录号:KR050213)和Bg TPS2(Gen Bank登录号:KR050214)。其中,Bg TPS1基因c DNA序列全长2 987 bp,开放阅读框(ORF)2 502 bp,编码833个氨基酸;Bg TPS2基因c DNA序列全长3 212 bp,开放阅读框2 469 bp,编码822个氨基酸。Bg TPS1和Bg TPS2基因都主要在5龄幼虫脂肪体中表达,且Bg TPS2基因的表达量为Bg TPS1基因表达量的3.9倍。在两种不同极端温度诱导下,Bg TPS1和Bg TPS2基因mRNA均上调表达。其中,Bg TPS2的表达量始终显著高于Bg TPS1。在0℃时,Bg TPS1和Bg TPS2的表达量最高。【结论】德国小蠊5龄幼虫中存在2个TPS基因。两个TPS基因均在脂肪体中高表达,且Bg TPS2基因的表达量显著高于Bg TPS1基因;低温和高温诱导下均能促进两个基因的表达量上升。该结果为进一步明确昆虫海藻糖的合成途径及其在昆虫对温度逆境的反应中的作用研究奠定了基础。

耻垢分枝杆菌海藻糖合成酶基因TreS的克隆及其在大肠杆菌中的表达

耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)在环境胁迫下具有合成海藻糖的能力。实验采用PCR的方法,克隆了来源于耻垢分枝杆菌的一段核苷酸序列,与已报道的海藻糖合成酶有60%以上同源性,推测该基因的编码产物具有海藻糖合成酶的活性,为进行其功能验证而在大肠杆菌中进行了表达。目的蛋白以可溶性蛋白为主,约占细胞可溶性总蛋白48%,为目前相关报道的最高值。经活性测定,表达的重组酶无需复性,能够催化麦芽糖生成海藻糖,在20℃反应20 h对麦芽糖的转化率可达61%,具有较高的应用价值。

Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

利用PCR和TA克隆方法扩增和克隆得到了恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaS1的海藻糖合成酶基因treS。对其进行序列分析表明,其编码区含有2067bp,编码含688个氨基酸残基的蛋白质,其核苷酸序列和蛋白质序列与来源于其它假单胞菌属细菌的海藻糖合成酶的序列表现出了较高同源性。将该基因序列与表达载体pQE30T连接,构建重组质粒pQE30T-TS,并将其转化至E.coliM15菌株中。重组菌株经诱导表达后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有明显的分子量约77.5kD的特异蛋白条带出现。经测定酶活力达19U/mL,约是原始菌株P.putidaS1的50倍。

昆明假单胞菌HL22-2海藻糖合酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

采用热不对称交错聚合酶链式反应(Tail-PCR)克隆云南磷矿来源昆明假单胞菌(Pseudomonas kunmingensis)HL22-2的海藻糖合酶(TreS)基因HL22-2TreS,将该基因与表达载体pETM3C连接后在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)pLysS中进行异源表达,通过Ni-NTA柱纯化重组酶HL22-2TreS,并对其酶学特性进行分析。结果表明,HL22-2TreS基因全长3336 bp,编码1111个氨基酸,氨基酸序列与Genbank数据库中相关的海藻糖合酶具有极高的相似性。重组酶HL22-2TreS的分子质量约126 kDa,该酶的最适反应温度和pH值分别为40℃和7.0,在温度20~50℃及pH值6.0~9.0条件下比较稳定,Cu2+、Hg2+、Ba2+及Al3+对海藻糖合酶的活力有强烈的抑制效果。HL22-2TreS基因对麦芽糖和海藻糖的米氏常数(Km)分别为20.6 mmol/L和87.5 mmol/L,对麦芽糖具有更高的亲和性,更容易将麦芽糖转化成海藻糖。

SH-110菌海藻糖合成酶基因克隆、表达及酶学性质研究

为找到理想的工业化生产海藻糖合成酶基因工程菌,以长白山温泉SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增编码Tres基因片段,克隆至pET-30a(+)原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3),实验中采用IPTG和乳糖同时进行对比诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质研究。成功克隆了2912bp的Tres基因,实验中发现加入IPTG和乳糖后,融合蛋白在胞内都得到了表达,而且添加乳糖诱导的蛋白表K达+量、Z偏n2+高对。重表组达酶重有组明酶显T激res活相作对用分,子Ba量2+、约C为u2+1、1M0nk2D+有a,明最显适抑作制用酶温活度作60用℃。,最重适组p酶H7的.0动。力金学属常离数子KCam2为+、8.823mmol/L和Vmax为235.29mmol/L。已成功在大肠杆菌表达重组Tres,为进一步研究利用基因工程菌生产大量海藻糖合成酶,进行大规模生产海藻糖提供理论依据。

麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法,从芝田硫化叶菌B12中扩增了麦芽寡糖基海藻糖合酶基因(TreY),扩增产物大小为2.2kb,将扩增片段与pUCm-T连接,得到重组质粒pUCm-T-TreY,CaCl2法转化DH5α,并筛选阳性克隆。用BamHI/NdeI分别双酶切pUCm-T-TreY和表达载体pET21a,连接后得重组pET21a-TreY,转化大肠杆菌DE3并进行了表达。表达产物经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为74kDa的特异条带,同核苷酸序列所推导的值相符。

Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶表达质粒的构建及诱导条件优化

采用PCR方法从Pseudomonas putidaS1中克隆出编码海藻糖合成酶的基因treS,并与质粒pQE30T相连,构建了表达质粒pQE-TS2。将此重组质粒转化宿主菌E.coliM15进行诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳结果表明,treS基因在大肠杆菌中获得了高效表达。通过对诱导温度、诱导剂浓度、加诱导剂时间和诱导时间的优化研究,在菌液生长至OD600值为0.6时,加入诱导剂IPTG至终浓度0.01 mmol/L,20℃诱导20 h,蛋白的表达量达到每克干细胞89 mg的蛋白,粗酶液酶活达到19 U/mL。

草地贪夜蛾海藻糖合成酶基因的克隆、时空表达谱及对温度胁迫的响应

【目的】本研究旨在通过克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因SfTPS,分析其在草地贪夜蛾不同发育阶段、不同组织中的表达水平及不同温度胁迫时5龄幼虫中的相对表达量,为进一步探究TPS在草地贪夜蛾生长发育及抗逆应激反应中的功能奠定基础。【方法】运用RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾SfTPS的全长编码区,并进行生物信息学分析。运用RT-qPCR技术检测SfTPS在草地贪夜蛾不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(体壁、中肠和脂肪体)中和经短期(2,4和8 h)高(35℃)低温(10℃)胁迫后5龄幼虫中的表达变化。【结果】克隆获得2571 bp的草地贪夜蛾TPS cDNA序列,命名为SfTPS(GenBank登录号:MT920672),全长开放阅读框(ORF)长2481 bp,编码的826个氨基酸具有TPS和TPP两个保守结构域。同源比对和系统进化分析表明,昆虫TPS蛋白具有较高的保守性,SfTPS与斜纹夜蛾S.litura的TPS亲缘关系最近,序列一致性达到99.15%。SfTPS中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲占比分别为38.14%,12.23%和48.55%;SfTPS的三级结构为同源二聚体。RT-qPCR结果表明,SfTPS在草地贪夜蛾卵期和1-5龄幼虫期低表达,在6龄幼虫期、蛹期和成虫期高表达,且草地贪夜蛾变态前后SfTPS的表达量变化较大。组织分布结果显示,SfTPS在5龄幼虫脂肪体中表达量最高。草地贪夜蛾5龄幼虫经2~8 h低温(10℃)和高温(35℃)胁迫后,SfTPS的相对表达量显著高于对照(25℃),分别为对照的4.43~9.34和2.50~6.03倍。【结论】SfTPS基因在草地贪夜蛾生长发育过程及抵御高低温度胁迫中可能具有重要作用。

耐辐射奇异球菌R12海藻糖合成酶基因的克隆与表达

耐辐射奇异球菌(Deinococcus wulumuqiensis)R12在环境胁迫下具有合成海藻糖的能力。采用PCR方法从耐辐射奇异球菌R12基因组中分离得到分子量约1 700bp的海藻糖合成酶基因,为验证其功能而在大肠杆菌中进行了表达,经IPTG诱导表达出约66kDa的目的蛋白。经酶活检测发现,目的蛋白能够催化麦芽糖一步合成海藻糖。以30%麦芽糖为底物反应1h,进行海藻糖转化实验,结果表明,重组海藻糖合成酶的最适反应温度为35℃、最适反应pH值为8.0,转化率达67%,具有较高的应用价值。

重组嗜热栖热菌海藻糖合酶制备海藻糖的工艺条件优化

海藻糖具有独特的生物活性,在多种行业应用广泛。海藻糖合酶能够专一性催化麦芽糖一步生成海藻糖。本文通过PCR扩增获得了来源于Thermus thermophilus ATCC33923的海藻糖合酶基因Tre S,构建了基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-24a(+)-Tre S。工程菌在摇瓶中发酵28 h时,胞内海藻糖合酶酶活达到最高值为6.4 U/m L。进一步研究了该重组酶制备海藻糖的影响因素,发现当以10%麦芽糖为底物,初始反应p H 7.5,加酶量为15 U/g麦芽糖,40℃,150 r/min反应24 h,转化率达到最高值,为49.0%。当底物浓度提高至20%~40%时,转化率为45.4%~46.2%。

玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因克隆、表达及功能鉴定

目的:克隆玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因(Srt)使其在大肠杆菌XL10-Gold中高效表达,并对重组酶的酶学特性进行研究。方法:利用PCR技术从玫瑰链霉菌中克隆到一段长1 704bp的海藻糖合成酶基因(Srt),构建重组表达质粒pSE380-Srt-treS,将其转化大肠杆菌XL10-Gold中诱导表达,对重组纯酶进行SDS-PAGE分析及酶学特性测定。结果:SDS-PAGE显示在65kDa处有明显单一蛋白条带。该酶可催化麦芽糖和海藻糖之间的可逆反应,海藻糖得率达82%,且含有很低的副产物葡萄糖(5%左右)。最适反应温度和pH分别为30℃、7.5,Cu2+、Zn2+和Tris能明显抑制酶活力。该酶还可催化蔗糖生成一种无龋齿,适合糖尿病患者食用的糖类-海藻酮糖。结论:成功克隆表达了一个海藻糖合成酶基因,该酶转化率高,副产物较少,为工业酶法生产海藻糖奠定基础。

海藻糖合成酶基因的克隆及原核表达

目的克隆海藻糖合成酶(Trehalose synthase,Tres)基因,并在大肠杆菌中表达重组酶。方法以长白山温泉Thermus thermophilus SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增Tres基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-Tres,转化E.coli BL21(DE3),分别采用IPTG和乳糖诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot和薄层色谱(Thin layer chromatography,TLC)分析。结果重组表达质粒pET-30a(+)-Tres经双酶切及测序证实构建正确;IPTG和乳糖均能诱导重组蛋白的表达,且乳糖诱导的蛋白表达量较高;表达的重组酶Tres相对分子质量约为110 000,可与鼠抗6×His单克隆抗体特异性结合;粗酶液的酶活力为8 760 U/μg,是野生菌酶活的10倍;重组酶水解麦芽糖产物经TLC分析证实,其具有较强的海藻糖合成酶活性。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组Tres,为大规模生产海藻糖奠定了基础。

水生栖热菌FL-03海藻糖合酶基因克隆及原核表达

海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS)属于α-淀粉酶家族(α-amylase family),是生物体内通过TreS途径生成海藻糖的一种酶类。利用PCR技术,从水生栖热菌FL-03菌株FL-03中扩增了海藻糖合酶基因(TresC01),将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),得到重组质粒P-TresC01,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为110ku的特异条带,并经Western blotting分析鉴定,表明成功构建重组质粒P-TresC01并在大肠杆菌中表达,为进一步的研究奠定基础。