普通小麦-百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum)二体异附加系的选育与鉴定

为转移与利用百萨偃麦草耐盐、抗病等优良基因 ,用普通小麦中国春 百萨偃麦草双倍体与中国春杂交 ,通过染色体C 分带、分子原位杂交并结合减数分裂中期Ⅰ的染色体配对分析 ,从回交后代中选育出一套小麦 百萨偃麦草二体异附加系。对这套异附加系进行的鉴定与分析表明 ,各附加系除添加了一对百萨偃麦草染色体外 ,小麦的 2 1对染色体未见明显变化。各附加系所添加的百萨偃麦草染色体在减数分裂中期Ⅰ配对基本正常 ,仅有少量单价体 ,其自交后代中外源染色体亦能正常传递。这说明所培育的这套二体异附加系在细胞学上已相对稳定 ,暂分别编号为DAJ1 、DAJ2 、DAJ3、DAJ4 、DAJ5、DAJ6 和DAJ7。

THINOPYRUM BESSARABICUM和THINO-PYRUM ELONGATUM的基因组关系研究

对 2个八倍体 C.S- Thinopyrum bessarabicum( AABBDDJJ,2 n=8x=56)和 Goshawk( GHK) - Thinopyrum elongatum( AABBDDEE,2 n=8x=56)的根尖细胞染色体进行 C-分带 ,从中分检出 Th.bessarabicum和 Th.elongatum的各自染色体进行核型分析 ,结果表明 :Th.bessarabicum和 Th.elongatum的大多数染色体都具有端带 ,但 Th.bessarabicum的端带更强 ,很少有中间带 ;而 Th.elongatum的染色体除 E1外其它染色体的端带较弱 ,而且带纹较丰富 ,有较多的中间带。对 C.S- Th.bessarabicum和 GHK- Th.elongatum进行有性杂交 ,其杂交种F1的 PMC染色体在 MI的平均配对构型为 1 5.50 + 5.0 3 [+ 1 4.2 0 ○ + 0 .40 + 0 .2 1 ,其中 Th.bessarabicum和 Th.elongatum染色体平均配对成 2 .5个二价体 ,由 C-分带显示大多数 Th.bessarabicum和 Th.elongatum染色体呈单价体状态。因此推断 ,Th.bessarabicum和 Th.

普通小麦中国春-百萨偃麦草异染色体系的分子标记分析

综合利用HMW-Glu亚基、STS、SSR和RFLP等分子标记对普通小麦中国春、百萨偃麦草、中国春-百萨偃麦草双二倍体和11个中国春-百萨偃麦草异染色体系进行了分析。结果表明,14对SSR、10对STS引物和6个RFLP标记可以特异追踪百萨偃麦草染色质。C7-17及其后代株系C7-17-2等编码百萨偃麦草特异HMW-Glu亚基,添加染色体涉及与小麦第1部分同源群染色体部分同源的1J;1对STS、3对SSR和1个RFLP探针可以特异追踪二体附加系CH05中的百萨偃麦草染色体,并揭示最初根据分带核型确定的J3与小麦第2部分同源群染色体具有较高的部分同源性;2对STS、1个RFLP探针和1对SSR可以追踪CH09的外源染色体,并揭示最初确定的J7与小麦第3部分同源群染色体具有较高的部分同源性;1对STS和1个RFLP探针在CH03、CH04和CH34中具有相同的多态,3个附加系可能添加了相同染色体,最初确定的J1、J2和J?与小麦第7部分同源群染色体具有较高的部分同源性;3对SSR引物可以特异追踪CH12中附加的大片段易位染色体和CH11中的小片段易位染色体,推测易位可能涉及同一条百萨偃麦草染色体。发现13个标记(5个STS、3个RFLP探针和5个SSR)可以追踪未涉及到的4J和5J等染色体。

普通小麦-百萨偃麦草染色体易位的选育与鉴定

利用染色体C 分带、基因组原位杂交和花粉母细胞减数分裂分析的方法 ,从普通小麦中国春与中国春 百萨偃麦草双倍体回交BC1F5 代中选育出 5份纯合易位新种质 ,分别为 :含 1对易位染色体并添加 1对百萨偃麦草完整染色体的Tj0 1和Tj0 2 ;添加 1对易位染色体的Tj0 3 ;含 1对易位染色体并添加 1对百萨偃麦草某一染色体臂端着丝粒染色体的Tj0 4和含 1对易位染色体并添加 2对百萨偃麦草完整染色体的Tj0 5。这些易位染色体的易位断点均不在着丝粒处 ,能稳定传递 ,且所涉及的植株生长和结实均正常。推测在该回交后代中小麦与百萨偃麦草染色体之间发生了自发的部分同源重组 。

大赖草及近缘物种原位杂交和Southern杂交的分析

用Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍｂｅｓａｒａｂｉｃｕｍ（Ｓａｖｕｌ．＆Ｒａｙｓ）Ａ．Ｌｖｅ的基因组ＤＮＡ作探针，分别与大赖草Ｌｅｙｍｕｓｒａｃｅｍｏｓｕｓ（Ｌａｍ．）Ｔｚｖｅｌ．和脆轴偃麦草Ｔｈ．ｊｕｎｃｅｕｍ（Ｓａｖｕｌ．＆Ｒａｙｓ）Ａ．Ｌｖｅ的体细胞杂交，大赖草的１４对染色体均出现杂交信号，脆轴偃麦草只有７对染色体有杂交信号。在用重复ＤＮＡ序列ＰＨｖ６２作探针的原位杂交中，Ｔｈ．ｂｅｓａｒａｂｉｃｕｍ有４对染色体有杂交信号，大赖草有１３对染色体显示杂交信号，新麦草Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓｊｕｎｃｅａ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｎｅｖｓｋｉ和脆轴偃麦草无杂交信号。用ＰＨｖ６２作探针的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果与原位杂交相似。在被检测的１２个普通小麦大赖草异源染色体系中，除二体附加系中５Ｌｒ＃１和双二体附加系１Ｌｒ＃１＋５Ｌｒ＃１没有杂交信号外，其余的异染色体系与ＰＨｖ６２都有特异杂交信号。据此推测Ｔｈ．ｂｅｓａｒａｂｉｃｕｍ有可能参予了赖草属物种的形成过程。但是，大赖草的染色体组在进化过程中显然已发生过变异。

简单重复序列(AAG)_5在百萨偃麦草染色体上的分布

百萨偃麦草是小麦亲缘物种之一,对环境胁迫和生物胁迫具有很强的抗性,是小麦遗传改良的重要资源。为了对导入的外源染色体及片段进行有效鉴定,利用荧光原位杂交方法,研究了合成的简单重复序列(AAG)5在百萨偃麦草染色体上的分布情况。结果表明,(AAG)5在百萨偃麦草上有多个位点,利用(AAG)5作探针可以将百萨偃麦草的各条染色体区分开来。

盐胁迫对中国春-百萨燕麦草双二倍体SOD、CAT活性和MDA含量的影响

利用不同浓度的NaCl溶液对中国春-百萨偃麦草双二倍体进行盐胁迫处理,测定不同盐浓度下中国春-百萨偃麦草双二倍体叶片中SOD、CAT两种保护酶的活性及MDA的含量变化。在盐胁迫下中国春-百萨偃麦草双二倍体SOD活性随着盐浓度升高出现三个升降过程。在盐浓度高于300mmol/L的处理时,中国春-百萨偃麦草双二倍体SOD活性均高于对照中国春;盐胁迫下中国春和中国春-百萨偃麦草双二倍体CAT活性均出现先升高后降低趋势。在盐浓度高于300mmol/L的处理时,中国春-百萨偃麦草双二倍体CAT活性均高于对照中国春,且两者的CAT活性均存在下降趋势。中国春-百萨偃麦草双二倍体的CAT活性总的下降幅度明显低于中国春;随着盐胁迫浓度的增加,中国春膜脂化产物MDA含量逐渐升高,而中国春-百萨偃麦草双二倍体MDA含量变化不大,总体维持5.59±0.98umol/L。在盐浓度高于300mmol/L处理时,中国春MDA含量显著高于双二倍体。结果表明:中国春-百萨偃麦草双二倍体在较高盐浓度处理下,表现出较强的抗氧化酶活性,活性氧清除能力增加;质膜伤害程度保持相对稳定,以较低的水平积累MDA。中国春-百萨偃麦草双二倍体具有较好的耐盐性,可作为小麦抗盐育种的种质资源。

45SrDNA在百萨偃麦草染色体上的分布

百萨偃麦草是小麦亲缘物种之一,对环境胁迫和生物胁迫具有很强的抗性,是小麦遗传改良的重要资源。为了对导入的百萨偃麦草染色体及片段进行有效鉴定,创造新种质。利用顺序分子原位杂交方法,研究了45SrDNA在百萨偃麦草染色体上的分布情况。结果发现45SrDNA在百萨偃麦草上有1对主位点,但在百萨偃麦草1J染色体上没有观察到45SrDNA位点的存在。

百萨偃麦草高分子量麦谷蛋白亚基的鉴定及其染色体定位

经SDS-PAGE电泳和W estern杂交,在百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum)中鉴定出1个高分子量麦谷蛋白亚基,其电泳迁移率大于“中国春”小麦的1Dy12亚基,本研究命名为1Ebx亚基,其编码基因命名为Glu-1Ebx。对由百萨偃麦草衍生的双二倍体及其1套二体附加系进行SDS-PAGE分析,只有百萨偃麦草、双二倍体和1Eb附加系表达1Ebx亚基,小麦亲本及其它附加系均不表达此亚基。用1对HMW-GS通用引物对上述材料进行扩增时,只有在百萨偃麦草、双二倍体和1Eb染色体附加系的基因组DNA中扩增出分子量大小一致的DNA片段,与SDS-PAGE的定位结果一致。表明1Ebx亚基是由百萨偃麦草1Eb染色体上的HMW-GS基因所编码。

基于RNA-seq的百萨偃麦草染色体特异分子标记开发与应用

【目的】百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum L?ve,2n=2x=14,JJ或EbEb)是小麦改良的重要亲缘物种,开发染色体特异分子标记对于加快其有利基因向小麦中的转移和应用有重要意义。【方法】利用百萨偃麦草分蘖期叶片RNA-seq获得的EST序列与节节麦D基因组序列进行比对,鉴定出4 957条没有相似性的序列作为筛选百萨偃麦草特异序列的基础序列。从这些基础序列中随机选择部分序列设计EST-PCR引物507对,通过在普通小麦中国春、百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中的扩增分析,筛选出百萨偃麦草基因组特异标记,然后在已经选育出的8个小麦-百萨偃麦草异染色体系中进行染色体定位,并探讨这些标记在小麦染色体工程中的应用潜力;根据谷类作物的共线性,以百萨偃麦草EST序列设计共线性引物100对,并比较这些引物的扩增和定位结果。【结果】在开发的507对引物中,204对(40.2%)在百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中具有特异扩增,多态率远高于利用小麦(12%)和百萨偃麦草(14%)EST设计的234对共线性引物产生的多态率,建立了高效开发小麦亲缘物种特异标记的新方法;利用8个中国春-百萨偃麦草异染色体系,共定位了198个百萨偃麦草特异标记,分别位于染色体1J(31)、2JS(15)、2JL(26)、3JS(20)、4JS(12)、4JL(12)、5J(27)、6JS(13)、6JL(22)和7JS(20),其中189个是根据百萨偃麦草转录组序列设计;利用定位于1J和6J的特异标记确定了4个易位系的染色体身份,其中1个涉及1J的大片段易位,2个涉及6JS的不同区段易位,1个为小片段中间插入易位;利用这些易位系,将30个1J和12个6J特异标记分别定位于2个物理区段。【结论】通过RNA-seq结合与小麦基因组序列比对可以获得小麦亲缘物种相对特异的EST序列并据此开发引物,建立了开发外源染色体特异标记的新方法,开发的标记可应用于小麦异易位系鉴定和缺失物理图谱的绘制。

百萨偃麦草ThbGSK和ThbHKT1基因的同源克隆与表达分析

百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum Lve,2n=2x=14,JJ)是小麦改良的重要亲缘物种。为了解GSK和HKT1基因在百萨偃麦草耐盐胁迫中的作用,本研究采用同源克隆的方法从百萨偃麦草中扩增获得了糖原合成酶激酶基因ThbGSK及高亲和性钾离子转运蛋白基因ThbHKT1的全长cDNA,ThbGSK基因全长1 233bp,与水稻、短柄草、小麦等物种的氨基酸一致性为93.92%～99.02%,表明GSK基因在这些物种间具有较高的保守性;聚类分析表明,ThbGSK与小麦TaGSK关系最近。ThbHKT1基因全长1 602bp,与水稻、小麦、短柄草、大麦等物种的氨基酸一致性为66.17%～92.87%,说明HKT1基因在这些物种间变异较大;聚类分析表明,ThbHKT1与大麦HvHKT1关系最近。RT-PCR和荧光定量PCR分析表明,经250mmol.L-1 NaCl胁迫处理后,GSK基因在百萨偃麦草和中国春诱导0～24h的叶片中表现为组成型表达,而HKT1基因在百萨偃麦草和中国春中均表现为诱导后上调表达。

寡核苷酸探针套涂染结合基因组原位杂交和分子标记分析准确鉴定小麦-百萨偃麦草异源易位系的研究

培育小麦异源易位系是转移和利用外源基因的有效途径,快速准确的染色体鉴定方法有利于提高染色体工程效率。本研究以电离辐射诱致的2个普通小麦-百萨偃麦草染色体5J易位系(NAU16YJ127和NAU16YJ124)为例,分析了综合利用本课题组前期开发的寡核苷酸探针套[包括(GAA)10、pSc119.2-1、pAs1-1、pAs1-3、AfA-3和AfA-4六个寡核苷酸探针]涂染,结合基因组原位杂交和分子标记等方法鉴定小麦异源易位系的效果。结果表明,NAU16YJ127(2n=6x=42)包含一对小麦-百萨偃麦草易位染色体T5JS·5JL-5AL#1,同时在染色体6A和2D长臂顶端也发生了明显的相互易位;NAU16YJ124(2n=6x=44)附加了一对小麦-百萨偃麦草易位染色体,同时包含一对6A长臂缺失染色体del6AL,其缺失区段易位到5JL近端部,形成T5JS·5JL-6AL,其他染色体未见明显变化。利用21个5J特异分子标记(19个位于长臂和2个位于短臂)分析发现,两个易位系均含有全部5J短臂标记,同时T5JS·5JL-5AL#1含有12个长臂标记,而T5JS·5JL-6AL仅含有2个长臂标记,确证两个易位系断点不同,并将21个标记定位于4个不同区段,其中位于5J短臂的2个标记位于1个区段,位于5J长臂的19个标记位于3个区段(5JL-1~3),分别包含2、10和7个标记;发现3个为可以同时识别5J和5A的共显性标记,其中NAU16YJ124含有全部5A标记,而NAU16YJ127仅包含其中2个标记,进一步验证了细胞学鉴定结果。本研究结果表明,寡核苷酸探针套涂染、基因组原位杂交和分子标记分析相结合为准确鉴定小麦异源易位系提供了新方法。

滨麦草与百萨偃麦草PHR1基因的克隆及序列分析

充分挖掘植物自身磷高效利用的生物学潜力,提高农作物对土壤难溶性磷的吸收和利用效率,对于培育磷高效利用的作物新品种、减少肥料投入和保护生态环境具有十分重要的意义。PHR1基因是植物磷信号调控网络的重要低磷应答转录因子,本研究利用同源克隆的方法,分别从小麦近缘植物滨麦草和百萨偃麦草中克隆获得了其PHR1基因序列。滨麦草Lm PHR1和百萨偃麦草Tb PHR1基因的ORF均为1 356 bp,编码451个氨基酸;与已报道的小偃54A1、B1、D1的PHR1基因高度同源,一致性达到98.63%;对两基因的氨基酸序列进行预测,结果表明它们均具有MYB-DNA结合结构域和一个预测的CC(Coiled coil)结构域;利用Clustal X软件对已报道的水稻、小麦等PHR1基因进行聚类分析并构建系统进化树,结果显示,Tb PHR1基因与二穗短柄草、水稻、玉米、拟南芥的PHR1基因在进化关系上更近一些,而Lm PHR1基因与其他植物的PHR1基因进化关系较远。