荧光猝灭法研究NADH、Thio-NAD^+与3α-HSD的相互作用

采用荧光猝灭法研究了两种辅酶,还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD+)与3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)的相互作用。研究结果表明,NADH和Thio-NAD+的加入均能使3α-HSD的内源性荧光发生猝灭,其猝灭机制均属于生成复合物的静态猝灭;25℃下NADH、Thio-NAD+与3α-HSD的结合常数分别为7.38×104、1.23×104L.mol-1;37℃下NADH、Thio-NAD+与3α-HSD的结合常数分别为4.69×104、9.74×103L.mol-1;NADH与3α-HSD的结合作用力为氢键和范德华力,Thio-NAD+与3α-HSD的结合作用力主要为静电引力和疏水作用力;NADH和Thio-NAD+均能使3α-HSD构象发生变化,导致色氨酸残基所处环境极性增大。

酶循环法检测血清总胆汁酸的方法学评价

目的通过对方法学评价试验,选择一种检测血清总胆汁酸的方法。方法Thio-NADH黄色发光系统酶循环法检测血清总胆汁酸。结果本法线性达150μmol/L,精密度高,批内CV分别为0.98%和0.85%,批间CV为4.58%和4.13%。本法与普通酶显色法比较,r=0.903x-1.45,r=0.9955,n=50,配对t检验P>0.05,胆红素<830μmol/L,血红蛋白<5g/L,肝素钠<120mmol/L,枸椽酸钠<120mmol/L,乳酸<30mmol/L,抗坏血酸<28mmol/L,对测定结果无显著性干扰。结论本法线性好,精密度高,结果无明显干扰,对仪器管道比色杯基本无色素沉着污染,是测定血清总胆汁酸的一种理想方法,值得扩广应用。

酶循环法测定血清总胆汁酸

采用氧化型β－硫烟酰胺腺苷二核苷酸（Thio－NAD）底物酶循环法测定血清总胆汁酸（TBA），对其方法学进行初步研究。该法灵敏度：试剂空白△A_(405nm（1cm）)0.004／min；50μmol／L△A_(405nm（1cm）)0.050／min；平均回收率99．2％；线性0～150μmol／L；精密度：批内CV＜1．0％：批间CV＜4．5％；该法（Y）和偶联黄递酶比色法（X）比较：Y＝0．88X－1．50，r＝0．9968；常用量抗凝剂、胆红素684μmol／L、血红蛋白5g／L、抗坏血酸0．5g／L、LDH14000U／L对测定无影响。该法生成物无色素污染、准确度及精密度好、干扰物少，是一种理想的TBA测定方法。

可见光直接光度法测定硫代氧化型辅酶

建立了可见光直接光度法测定硫代氧化型辅酶。方法为通过确定测定试剂中各组分最佳含量,建立了一种运用3а-HSD偶联的酶法光度法测定Thio-NAD＋。本法线性范围为0~2 mmol∕L,平均回收率为102.67%,批内变异系数（CV）和批间变异系数分别为1.50%~2.49%和2.44%~4.04%,线性回归方程和相关系数分别为Y=0.0467X＋0.0033,r=0.9985。本法具有选择性好、灵敏度高、测定简便等特点,能真实反映Thio-NAD＋浓度,对于提高Thio-NAD＋检测的效率、结果的准确性都具有重要意义。