清热化痰解毒方对脑缺血再灌注大鼠肺组织TXNIP/NLRP3炎性通路的影响

目的：探究清热化痰解毒方对脑缺血再灌注大鼠肺组织的影响,并初步探讨相关分子机制。方法：将SD大鼠分为假手术组、模型组、阳性药组（灌胃尼莫地平200 mg·kg^-1）、清热化痰解毒方低、高剂量组（100,200 mg·kg^-1）,每组10只,除假手术组外,采用改良4动脉阻断法制备大鼠全脑缺血再灌注损伤模型,造模后,给药3 d。肺湿/干重（W/D）分析,采用苏木素-伊红（HE）染色进行组织病理学分析;酶联免疫吸附法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞介素（interleukin,IL）-1β和IL-18水平;肺髓过氧化物酶试剂盒检测髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活性;免疫组化分析核苷酸结合域样受体蛋白3（nucleotide-binding domain-like receptor 3,NLRP3）阳性细胞数;半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）比色测定试剂盒检测Caspase-1活性;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA和蛋白表达,免疫共沉淀检测硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）-NLRP3蛋白表达。结果：与假手术组比较,模型组肺损伤评分,肺W/D,BALF中IL-1β和IL-18水平、总细胞和多形核白细胞数量,MPO活性均明显增加（P〈0.05）;与模型组比较,尼莫地平组、清热化痰解毒方低、高剂量组肺损伤评分,肺W/D,BALF中IL-1β和IL-18水平、总细胞和多形核白细胞数量及MPO活性均明显降低（P〈0.05）。与假手术组比较,模型组肺组织中NLRP3阳性细胞数,Caspase-1活性,NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白和mRNA相对表达明显增加（P〈0.05）;与模型组比较,尼莫地平组、清热化痰解毒方低、高剂量组肺组织中NLRP3阳性细胞数,Caspase-1活性,NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白和mRNA相对表达均明显降低（P〈0.05）。与假手术组比较,模型组肺组织中ROS产生,TXNIP蛋白表达均明显增加（P〈0.05）;与模型组比较,尼莫地平组、清热化痰解毒方低、高剂量组肺组织中ROS产生,TXNIP蛋白表达均明显降低（P〈0.05）。与假手术组比较,模型组肺组织中TXNIP-NLRP3蛋白共沉淀增加。与模型组比较,尼莫地平组、清热化痰解毒方低、高剂量组肺组织中TXNIP-NLRP3蛋白共沉淀减少。结论：清热化痰解毒方对全脑缺血再灌注大鼠的炎症性肺损伤具有保护作用,且这种作用可能通过抑制ROS产生,从而抑制TXNIP-NLRP3炎症通路介导的促炎介质IL-1β和IL-18的分泌,最终抑制肺组织中炎性细胞浸润,缓解肺组织损伤。

基于TXNIP/NLRP3/GSDMD信号通路探讨当归补血汤对糖尿病肾病大鼠足细胞焦亡的影响

目的:观察当归补血汤对糖尿病肾病(DKD)大鼠足细胞焦亡的影响,探讨其防治DKD及足细胞焦亡的可能作用机制。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为造模组42只和正常组8只,造模组大鼠高糖高脂饮食6周结合链脲佐菌素(STZ)35 mg·kg^(-1)一次性腹腔注射制备2型糖尿病模型。造模成功后随机分为模型组、当归补血汤低剂量(0.72 g·kg^(-1))组、当归补血汤高剂量(1.44 g·kg^(-1))组、厄贝沙坦(0.017 g·kg^(-1))组进行灌胃,正常组及模型组给予等体积生理盐水灌胃,每日1次,连续干预20周。给药期间定期检测各组大鼠空腹血糖(FBG),24 h尿蛋白(24 h-UTP);给药结束后采用过碘酸六胺银(PASM)染色观察肾组织病理形态学变化;透射电镜(TEM)观察足细胞超微结构变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β),白细胞介素-18(IL-18)水平;原位末端标记法(TUNEL)检测大鼠肾组织细胞DNA损伤情况;免疫组化法(IHC)检测大鼠肾组织硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP),半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1),消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平;免疫荧光(IF)三标法检测核苷酸结合域样受体蛋白3(NLRP3)及肿瘤蛋白-1(WT-1)在足细胞的表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肾组织TXNIP/NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路蛋白及足细胞突触足蛋白(Synaptopodin)表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠FBG,24 h-UTP显著升高,肾小球肥大,系膜增生,系膜外基质增加,基底膜增厚,出现K-W结节,肾小管上皮细胞空泡变性,足突融合或丢失,血清中IL-1β,IL-18含量明显升高,肾组织TUNEL阳性细胞明显增多,NLRP3在足细胞表达增多且WT-1在足细胞表达减少,Synaptopodin蛋白表达水平显著降低,TXNIP/NLRP3/Caspase-1/GSDMD蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,当归补血汤高剂量组明显降低FBG,24 h-UTP水平,明显改善肾组织病理学,改善足细胞的损伤和丢失,减少肾组织TUNEL阳性细胞数,NLRP3在足细胞表达减少且WT-1在足细胞表达增多,升高Synaptopodin蛋白表达水平,降低TXNIP/NLRP3/Caspase-1/GSDMD蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:当归补血汤可能通过调控TXNIP/NLRP3/GSDMD信号通路,抑制足细胞焦亡以减少蛋白尿,从而延缓DKD的发展进程。

减量应用吸入型糖皮质激素对稳定期COPD急性加重风险影响的单中心前瞻性随机对照试验

目的探讨吸入型糖皮质激素减量应用对稳定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重风险影响。方法选取2019年1月至2021年11月开封市中心医院145例稳定期COPD患者,根据吸入型糖皮质激素剂量分为高剂量组(50μg/500μg沙美特罗替卡松,n=73)和低剂量组(50μg/250μg沙美特罗替卡松,n=72);另设空白对照组(n=72),不给予糖皮质激素。比较三组疗效、急性加重次数、不良反应及治疗前后外周血单个核细胞硫氧还蛋白结合蛋白/Nod样受体蛋白3(TXNIP/NLRP3)炎性小体通路、肺功能指标[第1秒用力肺活量占预计值的百分比(FEV1%)、第1秒用力呼气量(FEV1)、第1秒用力呼气量占所有呼气量的比例(FEV1/FVC)]、多因素分级系统(BODE)指数、COPD评估测试量表(COPD assessment test,CAT)评分。结果低剂量组、高剂量组治疗总有效率(87.50%、89.04%)、COPD急性加重次数(次,0.90±0.35 vs.0.78±0.49)比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗前后三组TXNIP/NLRP3炎性小体通路(外周血单个核细胞TXNIP、NLRP3表达及差值)、肺功能指标(FEV1/FVC、FEV1、FEV1%水平及差值)、BODE指数、CAT评分及差值比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后低剂量组、高剂量组外周血单个核细胞TXNIP[低剂量组:(0.96±0.26 vs.1.21±0.33)、高剂量组:(1.01±0.24 vs.1.30±0.28)]、NLRP3表达[低剂量组:(1.20±0.28 vs.1.52±0.44)、高剂量组:(1.15±0.33 vs.1.48±0.47)]、BODE指数[分,低剂量组:(2.91±0.34 vs.4.26±0.42)、高剂量组:(2.84±0.40 vs.4.14±0.55)]、CAT评分[分,低剂量组:(18.21±1.46 vs.23.61±2.73)、高剂量组:(17.75±1.74 vs.23.19±2.78)]均低于治疗前(P<0.05)。低剂量组不良反应发生率(8.33%)低于高剂量组(20.55%,P<0.05)。结论吸入型糖皮质激素低剂量、高剂量应用于稳定期COPD均可有效缓解炎症反应,改善肺功能及临床症状,预防稳定期COPD急性加重,且低剂量应用不良反应较少,更具安全性。

黄芪甲苷调控细胞焦亡减轻肠缺血再灌注损伤的分子作用机制

目的:采用网络药理学和体内实验结合的方法研究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)调控细胞焦亡(Pyroptosis)减轻肠缺血再灌注损伤(IRI)的作用机制。方法:首先从中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)数据库和Swiss Target Prediction数据库中检索获得AS-Ⅳ的对应靶点基因,并从GeneCards数据库中检索得到肠IRI和Pyroptosis相关的靶点基因,通过解螺旋网站绘制Venn图,获得三者的共同靶点基因。通过STRING数据库、Cytoscape软件构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络筛选共同靶基因并导入Cytoscape软件获得核心靶基因。微生信平台用于基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析并预测AS-Ⅳ调控Pyroptosis减轻肠IRI的作用机制。然后采用随机数字表法,将C57/BL6J小鼠随机分为5组,正常组、模型组、给药组(IR+AS-Ⅳ)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)激动剂NSS组(IR+AS-Ⅳ+NSS)、NLRP3抑制剂MCC950组(IR+AS-Ⅳ+MCC950)。模型组、给药组、NLRP3激动剂NSS组、NLRP3抑制剂MCC950组采用夹闭肠系膜上动脉45 min恢复灌注2 h建立肠IRI模型,正常组仅分离血管不夹闭。给药组、NLRP3激动剂NSS组、NLRP3抑制剂MCC950组于造模前连续3 d灌胃溶于0.1%二甲基亚砜的黄芪甲苷(50 mg·kg^(-1)),末次灌胃时间为造模前2 h,其余2组灌胃等量的生理盐水。NLRP3激动剂NSS组于造模前1 h腹腔注射4 mg·kg^(-1)的NSS,NLRP3抑制剂MCC950组于造模前1 h腹腔注射10 mg·kg^(-1)的MCC950。再灌注2 h处死小鼠,获取肠组织。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测白细胞介素(IL)-18,IL-1β水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)、NLRP3、胱天蛋白酶(Caspase)-1、焦孔素D(GSDMD)蛋白表达,Chiu's评分评估小鼠肠组织病理学变化。结果:网络药理学分析表明肠IRI的靶点有1599个,AS-Ⅳ的作用靶点有199个,Pyroptosis的靶点有197个,三者共同靶点有20个。核心靶点有10个,包括NLRP3、TXNIP、沉默信息调节因子1(SIRT1)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、IL-18、GSDMD、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等。共同靶点的KEGG富集筛选出的通路相关性最大的是NOD样受体通路。体内实验结果表明,与正常组比较,模型组Chiu's评分升高,小鼠肠组织IL-18,IL-1β炎症因子水平明显升高(P<0.05),TXNIP、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,给药组和NLRP3抑制剂MCC950组Chiu's评分降低,小鼠肠组织IL-18,IL-1β炎症因子水平明显降低(P<0.05),TXNIP、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与给药组比较,NLRP3激动剂NSS组Chiu's评分升高,小鼠肠组织IL-18,IL-1β炎症因子水平明显升高(P<0.05),NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与NLRP3抑制剂MCC950组比较,NLRP3激动剂NSS组Chiu's评分升高,小鼠肠组织IL-18,IL-1β炎症因子水平明显升高(P<0.05),TXNIP、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:网络药理学预测结果与体内实验结果一致,黄芪甲苷通过TXNIP/NLRP3信号通路抑制细胞焦亡以减轻IRI。