Thoc1真核表达载体构建及其与ClC-3蛋白在人宫颈癌细胞HeLa中的共定位观察

目的克隆Thoc1基因并构建pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体,观察Thoc1和氯离子通道3(ClC-3)在人宫颈癌细胞HeLa中的共定位情况,分析ClC-3是否参与细胞转录过程。方法采用RT-PCR法扩增获得Thoc1基因的编码序列,将其克隆到p DsRed2-N1载体中,构建pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体,经PCR、SacⅠ和Bam HⅠ双酶切、基因测序进行鉴定。将对数生长期HeLa细胞随机分为转染组、空转染组及空白对照组,分别采用Lipofectamine 2000转染pThoc1-DsRed2-N1质粒、p DsRed2-N1质粒及脂质体,转染48 h倒置荧光显微镜下观察红色荧光蛋白表达情况。取转染组细胞,采用免疫荧光技术观察Thoc1和ClC-3的共定位情况。结果 PCR鉴定结果显示在约2.1 kb处有一亮带;双酶切得到约4.7 kb和2.1 kb的两个片段,符合预期大小;基因测序结果显示与Genebank中Thoc1基因序列完全一致;证实成功构建pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体。空转染组可观察到较强的红色荧光,空白对照组没有观察到红色荧光,转染组红色荧光强度介于空转染组与空白对照组之间;证实HeLa细胞中存在Thoc1表达。ClC-3分布于细胞核和细胞质中,主要是细胞核中;Thoc1只分布于细胞核中;两者叠加后在细胞核呈黄色荧光,证实ClC-3和Thoc1在HeLa细胞核上存在共同定位。结论成功构建了pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体;Thoc1与ClC-3共定位于HeLa细胞核,提示ClC-3可能参与细胞转录过程。