水蛭素对大鼠实验性脑出血急性期保护作用的研究

目的:通过观察凝血酶特异性抑制剂-水蛭素对脑出血后血肿周围组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达及脑组织含水量变化的影响,探讨水蛭素在脑出血后继发性损伤中的保护作用。方法:采用自体未抗凝动脉血注入法,制作实验性脑出血动物模型。将大鼠随机分为正常对照组,脑出血组,水蛭素组。光镜下定性观察脑出血后血肿周围组织的病理变化;采用干湿比重法定量测定脑组织含水量;免疫组化染色观察脑出血后GFAP的变化。结果:光镜示从脑出血后6 h开始血肿周围组织水肿进行性加重,3 d达高峰。脑出血后脑组织含水量逐渐增加,从1 d开始增加显著(P<0.05),3 d达高峰,7 d较3 d组虽有所下降,但与正常对照组相比差异显著。脑出血后1 dGFAP表达明显增强,随后持续增加,7 d达高峰。水蛭素组较相同时间点脑出血组血肿周围组织病理损伤减轻;脑组织含水量降低(P<0.05);GFAP表达有所下降(P<0.05)。直线回归分析表明,脑出血后1周内GFAP的变化与脑组织含水量变化呈正相关关系。结论:脑出血后1周内血肿局部应用凝血酶特异性抑制剂-水蛭素具有保护作用,并为脑出血的治疗提供一种新的给药途径。

局部应用重组水蛭素对脑出血模型大鼠血肿周边组织损伤的干预作用

目的 探讨脑出血后局部应用凝血酶特异抑制剂———重组水蛭素治疗血肿周边组织损伤的价值和治疗时间窗。方法 采用自体血注入方法建立大鼠脑出血模型 ,分别于 5 0 μl自体血注入同时、3h后以及 9h后血肿内给予 10U重组水蛭素干预 ,术后 72h记录大鼠神经功能缺损评分 (neurologicaldeficitscore ,NDS) ,检测血肿周边组织髓过氧化物酶 (MPO)的活性、脑水含量及TUNEL阳性细胞数量的变化 ,并通过检测血红蛋白含量评价水蛭素对血肿容量的影响。结果 脑出血同时及 3h后给予水蛭素可显著减轻大鼠神经功能缺损 ,降低局部MPO活性、减少脑水含量及TUNEL阳性细胞数量 ,9h后给予水蛭素仍可减轻局部组织脑水含量。与出血组比较 ,局部应用水蛭素未导致血肿红蛋白含量增加。结论 脑出血后早期 (9h内 )局部应用水蛭素可减轻血肿周边组织的白细胞浸润、脑水肿和细胞死亡 ,且无明显再出血副作用 ,抗凝血酶治疗有可能成为防治出血性脑损伤的有效措施之一。

水蛭素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

为研究重组水蛭素对凝血酶诱导的兔胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制。选用第2～5代培养的血管平滑肌细胞,在与凝血酶(4.0 ku/L)共同孵育的条件下,分别给予水蛭素(6.0 ku/L)和肝素(6.0ku/L)进行干预。通过四唑盐比色实验检测细胞生长活性,流式细胞术检测细胞周期,免疫组织化学检测血小板生长因子和增殖细胞核抗原在血管平滑肌细胞中的表达。结果发现,重组水蛭素能明显抑制凝血酶诱导的平滑肌细胞增殖,其抑制作用可能与减低了血管平滑肌细胞对血小板生长因子和增殖细胞核抗原的表达有关。

凝血酶对大鼠尾状核区神经细胞DNA损伤的动态研究

目的 研究脑出血血液凝固释放的凝血酶对神经细胞DNA的损伤 ,探讨脑出血神经细胞损伤的机制。方法 采用立体定位技术 ,将 15U凝血酶注入大鼠右侧尾状核 ,并用凝血酶的特异抑制剂水蛭素进行干预 ,于不同时相点测定TUNEL阳性细胞及caspase 3免疫反应性 (Immunoreactivity ,IR)细胞的表达。结果 凝血酶组TUNEL阳性细胞于造模后 12h出现 ,3d达到高峰 ,1周仍有较多表达 (P <0 0 1) ;caspase 3IR 6h开始表达 ,1d达高峰 ,1周仍有少量表达。水蛭素干预组TUNEL阳性细胞较凝血酶组明显减少 (12h ,1d ,3d ,1周 ,P <0 0 1) ;caspase 3IR较凝血酶组明显降低 (6h ,12h ,1d ,3d ,P <0 0 1;1周 ,P <0 0 5 )。结论 15U的凝血酶可导致大鼠尾状核区神经细胞DNA损伤 ,损伤持续时间 1周以上 ;凝血酶释放很可能是脑出血神经细胞凋亡的机制之一。

凝血酶诱导血管内皮细胞生长因子的表达及水蛭素的抑制作用

目的:研究凝血酶对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及重组水蛭素的作用。方法:将原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的第2-5代与凝血酶(4.0u·mL-1)共同孵育,按不同分组加入水蛭素(6.0u·mL-1)和肝素(6.0u·mL-1)。在不同时间,通过MTT比色检测细胞生长活性,以检测细胞损伤程度;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法评价VEGF mRNA的表达。结果:凝血酶对血管内皮细胞损伤的作用从2h即可出现,24h开 始减轻。凝血酶对VEGF的表达呈现双峰状:诱导后1h即有VEGF表达增高,2h减低后再次升高,24h达最高。 重组水蛭素可以有效地阻断凝血酶的上述作用。结论:凝血酶诱导HUVECs损伤并显著上调VEGF mRNA的表 达,该过程可被水蛭素有效抑制。

重组水蛭素与血栓前体关系的研究

氯胺－Ｔ法碘标水蛭素，采用固相饱和法、固相竞争法分析水蛭素与凝血酶－纤维蛋白原复合物的亲和力及定量结合关系，并分析水蛭素－凝血酶－纤维蛋白原复合物形成的时间反应动力学。结果显示，水蛭素可特异地与凝血酶－纤维蛋白原复合物形成三元复合物，它们的分子配比为１４∶１４∶１（水蛭素：凝血酶：纤维蛋白原）。生理Ｃａ^（２＋）浓度是它们的最佳结合环境，水蛭素与凝血酶－纤维蛋白原复合物结合的亲和常数Ｋ_ａ为９．７２ ×１０~６Ｌ／ｍｏｌ；其结合反应可在３０－４５ｍｉｎ达到平衡，提示水蛭素有作为血栓显像配基的可能性。

凝血酶调控肾小球系膜细胞产生明胶酶A、B的分子机制研究

在体外培养条件下观察了凝血酶对人肾小球系膜细胞表达细胞外基质降解酶——明胶酶Ａ（ＭＭＰ－２）及明胶酶Ｂ（ＭＭＰ－９）的调节作用。发现在无血清ＲＰＭＩ１６４０培养１２ｈ后，酶谱法显示系膜细胞培养上清液中ＭＭＰ－２活性极低，未检测出明显的ＭＭＰ－９酶解活性，但加入凝血酶后，可剂量依赖性地上调其ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９活性；ＲＴ－ＰＣＲ结果表明，在无血清ＲＰＭＩ１６４０培养１２ｈ后，系膜细胞仅表达低水平ＭＭＰ－９ｍＲＮＡ，加入凝血酶后，ＭＭＰ－９ｍＲＮＡ转录水平随刺激浓度的增加而明显上调，但凝血酶对ＭＭＰ－２ｍＲＮＡ的转录过程无明显影响；凝血酶的上述作用可被其特异性阻断剂——水蛭素部分性地拮抗。说明凝血酶分别在基因转录和（或）蛋白质修饰水平调节人肾小球系膜细胞表达ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９，从而参与肾小球组织重构及炎症性损伤。

水蛭素对凝血酶诱导血管内皮细胞与中性粒细胞表达黏附分子的影响

目的:研究水蛭素对凝血酶诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达细胞黏附分子(ICAM-1)和中性粒细胞表达膜整合素CD11b的影响。方法:用酶消化法获得HUVEC,密度梯度离心和重力沉降法分离人外周血细胞中性粒细胞。用酶联免疫吸附测定HUVEC在凝血酶、水蛭素作用下ICAM-1的变化,同时以免疫荧光流式细胞术检测中性粒细胞表达CD11b水平的变化。结果:与对照组相比,凝血酶诱导的HUVEC表达ICAM-1显著增多,随时间延长,ICAM-1的表达递增,高峰在24h。凝血酶使中性粒细胞CD11b的表达也显著上调,6h平均荧光强度明显增加,随时间延长逐渐升高,高峰在24h。水蛭素和肝素对凝血酶诱导的HUVEC表达ICAM-1和中性粒细胞表达CD11b均有明显的抑制作用,且水蛭素抑制ICAM-1的表达强于肝素,尤其在ICAM-1表达的高峰期,对CD11b表达的抑制作用水蛭素与肝素无明显差别。结论:水蛭素可以明显抑制凝血酶诱导的HUVEC表达ICAM-1和中性粒细胞表达CD11b。

大鼠脑出血后IL-1β表达及其与凝血酶的关系

目的观察大鼠实验性脑出血(ICH)后不同时间点血肿周围组织白细胞介素1β(IL-1β)炎性细胞表达及其与凝血酶的关系。方法免疫组化法观察ICH后不同时间点血肿周围IL-1β的表达情况及凝血酶对其表达的影响。结果在造模后1h,ICH组和凝血酶组血肿周围即可见IL-1β炎性细胞表达,6h达高峰,以后逐渐下降,48h无阳性细胞表达。在相应时间点,水蛭素组血肿周围IL-1β的表达水平均明显低于脑出血组(P<0.01),且细胞着色浅。假手术组仅有少量阳性细胞表达。结论IL-1β参与ICH后脑损伤,凝血酶可能通过促进IL-1β的表达而产生ICH后脑损伤作用。

水蛭素对大鼠急性心肌梗死后室性心律失常的影响

【目的】探讨凝血酶的直接抑制剂重组双功能水蛭素对大鼠急性心肌梗死后室性心律失常的影响及相关机制。【方法】将70只雄性SD大鼠随机分为10组:水蛭素(HIR)结扎前(HIR0min)组,HIR结扎后5min(HIR5min)组,HIR结扎后10min(HIR10min)组,HIR结扎后20min(HIR20min)组,HIR结扎后30min(HIR30min)组),和生理盐水(NS)对应的各时间组,即NS0min,NS5min,NS10min,NS20min,NS30min,最终每组7只。观察各组室性心律失常的发生情况,Evans法计量各组心梗面积及采用逆转录聚合酶链反应对各组缺血心肌组织的IP3R家族的三种亚型进行测定。【结果】水蛭素组发生室性心律失常的持续时间及心律失常评分较生理盐水组在结扎后5～20min均减少(P<0.05);IP3R家族的三种亚型均与心梗后室性心律失常持续时间呈正相关性;但IP3R2mRNA在结扎后10min及IP3R3mRNA在结扎后10min和20min,HIR组较NS组下调(P<0.05)。【结论】水蛭素有抗心梗后室性心律失常的发生作用,其机制可能为通过IP3R2和IP3R3实现的,而并非IP3R1。

凝血酶时间法测定家兔血浆中重组水蛭素

建立了凝血酶时间（thrombin time,TT）法测定国产重组水蛭素血药浓度的方法,以便为进一步研究该药在家兔体内的药物代谢动力学提供方法学基础.重组水蛭素血浆水平依其抗凝血酶活性（TT延长）予以测定.对该法的影响因素进行了探讨,最适测定条件确定为5 U/mL的凝血酶溶液,0.1 mol/L pH 7.4的Tris-HCL缓冲液及血浆各50 μL;结果发现对凝血酶时间延长百分率的对数与浓度呈线性相关,r为0.98～0.99;线性范围为0.12～0.60 mg/L,定量限为0.12 mg/L.日内和日间精密度（RSD）分别为5.6%～9.1%和9.2%～11.5%;方法回收率97.5%～99.2%;超出线性范围的高浓度血浆样品作2～100倍稀释,其稀释回收率为92.4%～94.8%.血浆样品在-20℃冰冻保存,至少1星期内稳定.应用本方法测定家兔iv重组水蛭素2.0 mg/kg后不同时间血药浓度,表明该药符合二室模型、一级动力学过程.

不同药物对人肺巨细胞癌PGCL3细胞表面表达的血小板免疫相关抗原的影响

利用铺有 Ｍａｔｒｉｇｅｌ的 Ｂｏｙｄｅｎ小室观察抗ＣＤ９、抗ＣＤ４２ａ、抗ＣＤ ６３、抗ＴＳＰ抗体对ＰＧ－ＣＬ３细胞侵袭作用的影响；采用流式细胞术观察２．５、１０、２０ｍｇ／Ｌ的川芎嗪、丹参酮ⅡＡ和５０、５００、１０００ Ｕ／Ｉ。的水蛙素和凝血酶对 ＰＧＣＬ３细胞膜表面 ＣＤ９、ＣＤ４２ａ、ＣＤ６３、ＴＳＰ表达的影响，观察川芎嗪、丹参酮ⅡＡ、水蛭素和凝血酶对人肺巨细胞癌ＰＧＣＬ３细胞表面血小板免疫相关抗原ＣＤ９、ＣＤ４２ａ、ＣＤ６３和ＴＳＰ表达的影响，部分阐述各种药物对肿瘤粘附和侵袭影响的不同作用机制。结果抗ＣＤ９抗体明显增加 ＰＧＣＬ３细胞的侵袭，而抗ＣＤ４２ａ、抗ＣＤ６３、抗ＴＳＰ抗体不同程度减少ＰＧＣＬ３细胞的侵袭。川芎嗪可使ＣＤ９＋、ＣＤ４２ａ＋、ＴＳＰ＋细胞的数目减少，ＰＧＣＬ３细胞表面ＣＤ９的表达减少；丹参酮ⅡＡ使ＣＤ９的表达有所增加，ＣＤ６３和 ＣＤ４２ａ的表达有所下降，ＣＤ４２ａ＋、ＴＳＰ＋的细胞数目下降；水蛭素使ＣＤ９、ＣＤ６３和ＣＤ４２ａ的表达有所减弱，ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ６３＋细胞的比例下降；凝血酶使ＣＤ９和ＣＤ４２ａ的表达有所减弱，并使ＣＤ４２ａ＋的细胞数目减少。提示川芎嗪、丹参酮ⅡＡ、水蛭?

大鼠脑出血后IL-1β表达及凝血酶的干预作用

目的观察在大鼠实验性脑出血(ICH)后不同时间点血肿周围白细胞介素-1β(IL-1β)表达情况及凝血酶对其影响。方法采用自体血、凝血酶注入法分别制作大鼠模型,应用免疫组化法观察不同时间点各组大鼠IL-1β的表达情况及凝血酶对其表达的影响。结果在造模后1h,脑出血组和凝血酶组病灶周围即可见IL-1β表达,6h达高峰,以后逐渐下降,48h阳性细胞基本消失。在相应时间点,ICH+水蛭素组血肿周围IL-1β的表达水平均明显低于ICH组(P<0.01),且细胞着色浅,凝血酶+水蛭素组病灶周围IL-1β的表达水平均明显低于凝血酶组(P<0.01),且细胞着色浅。假手术组仅有少量阳性细胞表达。结论IL-1β参与了ICH后脑损伤,凝血酶可能通过促进IL-1β的表达而发挥脑损伤作用。

脑出血后脑组织水、离子变化及水蛭素的作用

目的 探讨自发性脑出血脑水肿的发生机制及水蛭素的作用。方法 利用大鼠自体新鲜无肝素未凝动脉血定量脑出血模型 ,观察不同时间大鼠脑出血周围脑组织含水量、离子含量的变化 ,并以大鼠脑出血后脑内注射凝血酶特异抑制剂水蛭素的实验 ,研究水蛭素对水肿程度及离子含量变化的影响。结果 大鼠脑出血后早期脑组织含水量、离子随时间推移而升高、变化 ,而水蛭素可减轻其水肿程度及离子变化 (P <0 .0 5 )。结论 凝血酶与实验性脑出血脑水肿的产生发展关系密切 ,早期应用水蛭素可减轻脑出血脑水肿。

纤维蛋白原平板法测定水蛭素活性

目的:报告一种新的水蛭素活性测定方法——纤维蛋白原平板法。方法:以纤维蛋白原作为底物,在纤维蛋白原平板上进行免疫扩散反应,精确测量沉淀圈直径,绘制标准凝血酶活力标准曲线。在标准曲线上查出凝血酶与水蛭素反应后的剩余凝血酶活力,计算出水蛭素活性。结果:系列活力浓度10、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125NIH/ml的标准凝血酶其免疫扩散沉淀圈直径与酶活力呈良好的线性关系(r=0.9959)。结论:采用系列活力浓度的标准凝血酶与被水蛭素抑制后的剩余凝血酶同在一块纤维蛋白原平板上进行免疫扩散反应的方法,实验成本低,操作简便,结果客观,准确度较好。

凝血酶诱导非小细胞肺癌血管内皮生长因子分泌的实验

目的探讨凝血酶对非小细胞肺癌细胞株A549分泌血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的促进作用及其机制。方法采用ELISA法检测凝血酶对A549细胞分泌VEGF的浓度以及水蛭素对其阻断作用。采用RT-PCR法检测凝血酶受体PAR-1在A549细胞中的表达。结果凝血酶在0.5～3U/ml的浓度范围内可以明显地增加VEGF的分泌,而<0.5U/ml时这种促进作用则不明显,水蛭素能够完全阻断凝血酶的这种促进作用。PAR-1在A549细胞中表达,而在正常的胎肺细胞(KMB-17)中并不表达。结论在一定浓度范围内,凝血酶能有效地促进A549细胞VEGF的分泌,而这种促进作用可能与PAR-1受体的表达有关。

活血药对人肺癌细胞粘附和侵袭的影响

目的：观察活血药川芎嗪、水蛭素、丹参酮ⅡＡ和凝血酶对高转移人巨细胞肺癌ＰＧＣＬ３（简称ＰＧＣＬ３）和低转移人肺腺癌ＰＡａ（简称ＰＡａ）细胞的粘附和侵袭的影响。方法：用不同浓度的川芎嗪、丹参酮ⅡＡ、水蛭素和凝血酶分别处理ＰＧＣＬ３和ＰＡａ细胞，观察ＰＧＣＬ３和ＰＡａ细胞单独或与血小板作用后对纤维粘连蛋白的粘附和Ｂｏｙｄｅｎ小室的侵袭改变。结果：川芎嗪、水蛭素和凝血酶在不同程度上增加ＰＧＣＬ３细胞的粘附，而丹参酮ⅡＡ抑制这种粘附。川芎嗪、丹参酮ⅡＡ和水蛭素抑制ＰＧＣＬ３细胞对Ｂｏｙｄｅｎ小室的侵袭，凝血酶明显促进这个过程。川芎嗪、丹参酮ⅡＡ、水蛭素抑制血小板与ＰＧＣＬ３和ＰＡａ细胞侵袭的协同作用，凝血酶对这个过程有促进作用。结论：活血药对肿瘤细胞的侵袭和转移可能既有抑制作用又有促进作用。

凝血酶对丘脑组织血脑屏障及水电解质含量的影响

目的 探讨凝血酶对丘脑组织是否具有毒性损伤作用以及损伤是否可逆。方法 在鼠脑室内注入凝血酶 ,于不同时间段测定丘脑组织的血脑屏障 (BBB)通透性、BBB破坏体积、水电解质含量 ,并以脑室内注入生理盐水和注入凝血酶后再注入水蛭素的动物为对照。结果 凝血酶注入后 6 h丘脑组织的 BBB即遭到破坏 ,组织发生水肿 ,同时 Na+、Ca2 +含量明显升高 ,K+含量明显降低 ;水蛭素可修复损伤的 BBB,减轻组织水肿 ,调整电解质紊乱。结论 凝血酶对丘脑组织具有毒性损伤作用 ,但这一损伤可被水蛭素逆转。

脑血康分散片的制备及其抗凝血酶活性测定

目的制备脑血康分散片并测定其抗凝血酶活性。方法采用水提醇沉法提取水蛭浸膏,以微晶纤维素作为主要辅料制备脑血康分散片,采用凝血酶滴定法测定其抗凝血酶活性。结果所制备的脑血康分散片抗凝血酶活性为23.3~29.2 U/片。结论该制剂工艺简单、操作方便;凝血酶滴定法简单且准确,可作为脑血康分散片质量控制的一个指标。

抗凝血药物水蛭素的纯化与鉴定

以湖南产日本医蛭（ＨｉｒｕｄｏｎｉｐｐｏｎｉａＷｈｉｔｍａｎ）嗉囊消化液作为原料，经三氯醋酸沉淀后用ＤＥＡＥ－纤维素柱层析一步纯化，反相ＨＰＬＣ脱盐后即可获得批量的水蛭素．对纯化的水蛭素进行了ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱、Ｎ端顺序分析及抗凝血酶活性分析．