水热法制备质谱专用提取多肽的金属螯合纳米磁珠

应用水热法合成质谱专用提取血清多肽的金属螯合纳米磁珠,可用于质谱对血清中多肽分布情况的研究,获得血清多肽谱．对磁珠进行透射电镜(TEM),原子力显微镜(AFM)和傅立叶红外光谱FT-IR的表征,显示该粒子粒径在70～90 nm．并通过质谱验证该金属螯合磁珠能有效提取血清中的多肽,该磁珠为质谱进行疾病诊断解决样品制备的技术难题,具有广阔应用前景．

量子点免疫标记法检测福氏志贺氏菌

研究基于抗原抗体反应捕获目标菌,结合生物素与亲和素间的特异性相互作用,联合免疫纳米磁珠磁性分离、免疫量子点荧光标记技术,运用荧光检测系统,建立了福氏志贺氏菌的定量检测模型。结果表明,福氏志贺氏菌菌浓度为102CFU/mL^105CFU/mL,相对荧光强度与菌浓度关系为FI=12.78lgN+15.941,呈良好的线性关系,决定系数R2=0.9761。进一步对模型的准确度和精确度进行验证,得到菌落浓度预测值与真实值差异小,检测相对标准偏差为1.8%,表明模型的准确度好,精密度高。该方法可简单、快速(2h)、高效地检测福氏志贺氏菌。

基于免疫纳米磁珠对福氏志贺氏菌的快速富集研究

利用纳米磁珠的超顺磁性,结合传统平板计数的方法,通过捕获效率,研究免疫纳米磁珠制备过程中抗体加入量以及免疫纳米磁珠捕获目标细菌时的加入量,并利用免疫纳米磁珠对纯菌液以及羊肉洗水中100、101、102、103CFU/mL的福氏志贺氏菌进行捕获。结果表明,志贺氏菌多克隆抗体(4～5mg/mL)结合1mL链酶亲和素纳米磁珠((180±20)nm,2mg/mL)的最佳量为70μL,免疫纳米磁珠捕获高浓度目标细菌(102～104CFU/mL)时的最佳加入量为60μL。对于纯菌液和羊肉洗水,其捕获限可分别达到100CFU/mL和101CFU/mL,并且捕获时间在1h之内。本研究优化了实验条件,为免疫磁珠快速富集目标菌提供了理论依据。

禽流感病毒快速检测中的纳米磁珠分离器设计及试验

为实现禽流感病毒快速检测中的纳米级免疫磁珠分离,该文设计了一种便携式环形六孔纳米磁珠分离器,通过瓦型钕铁硼永磁体的合理布局,采用高导磁率的坡莫合金制作导磁片并贴合离心试管外壁锥度,实现了满足试验要求的6个局部强磁场区域,实测分离器分离空间磁感应强度达1166.2 mT,最大磁场梯度达152.7 T/m。为考核磁分离器分离效率,分别开展了多点磁感应强度测量、磁珠分离效率初步观察、透射电镜辅助观察等定性试验,并从定性和定量角度分别采用灭活的禽流感H5N1病毒和大肠杆菌E.coli O157:H7,结合Dot-ELISA和平板菌落计数方法进行了30、100和180 nm磁珠分离效率考核试验。试验结果表明:对于30、100和180 nm磁珠,当分离时间分别大于等于60min、60和40s时,磁珠分离器对3种磁珠捕获效率均在96.5%以上,分离上清液中均无残留磁珠,磁分离系统稳定可靠。

免疫磁分离法高效富集牛奶中大肠杆菌O157:H7

目的建立一种免疫磁分离(immunomagnetic separation,IMS)方法高效富集大肠杆菌O157:H7。方法合成一种核壳型的纳米磁珠(magnetic nanobeads, MNBs),并基于制备的MNBs构建了IMS。通过优化制备免疫MNBs时抗体浓度, IMS过程免疫MNBs的用量和孵育时间,构建了高效的IMS方法。结果构建的IMS方法能够在35 min内完成牛奶中大肠杆菌O157:H7的高效富集,当大肠杆菌O157:H7浓度低于10~5 CFU/m L时,捕获效率高于93.4%,当菌浓度达到10~7CFU/mL,捕获效率仍大于50%。结论该方法简单高效,可被广泛应用于其他食源性致病菌检测的样品前处理。

一种新型纳米磁珠分离装置用于大肠杆菌O157：H7分离效率评价

免疫磁分离是一种食源性致病菌特异分离与高效富集的方法。由于常规的磁力架存在磁场强度和梯度均较低的不足,很难高效捕获纳米磁珠,因此本研究开发了一种新型的纳米磁分离器,并以大肠杆菌O157:H7为研究模型,利用平板菌落计数法,从分离时间、重复性和细菌浓度范围等方面开展了该纳米磁分离器结合不同粒径的纳米磁珠对大肠杆菌的分离效率评价。实验结果表明:对于30、100和180nm磁珠,当磁分离时间分别大于60min、60s和40s时,该纳米磁分离器对102-106 CFU·mL-1的大肠杆菌的捕获效率不小于95%,平行实验相对标准偏差不大于7.0%。

血红铆钉菇免疫调节蛋白基因克隆及其生物信息学分析和重组表达

为研究血红铆钉菇中克隆的一种新型真菌免疫调节蛋白基因以及其在毕赤酵母GS115中进行高效重组表达,采用同源克隆的方法从血红铆钉菇菌丝体基因组DNA中扩增得到一个新的真菌免疫调节蛋白基因——FIP-cru,构建FIP-cru真核表达重组载体,并在毕赤酵母GS115中进行FIP-cru重组表达。利用硫酸铵沉淀、琼脂糖镍纳米磁珠纯化目的重组FIP-cru蛋白,采用SDSPAGE和Western blot验证重组FIP-cru表达情况。利用体外血细胞凝集实验与MTT法检测r FIP-cru生物学活性。结果表明:FIPcru属于真菌免疫调节蛋白家族,包含342 bp,编码113个氨基酸,经生物信息学分析发现,FIP-cru与其他真菌免疫调节蛋白有较高的同源性。SDS-PAGE和Western blot检测表明FIP-cru在毕赤酵母GS115中正确重组表达,粗蛋白表达水平为148.5mg·L-1。纯化后的r FIP-cru可以在体外凝集小鼠和羊的血细胞而不凝集人血细胞,MTT法表明r FIP-cru可明显刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖。FIP-cru为一种新型真菌免疫调节蛋白,毕赤酵母高效重组表达的r FIP-cru具有良好的生物学活性。

环形六孔纳米磁珠分离器设计与试验

免疫磁珠分离技术在生物检测中的应用日益广泛,能提供高强度大梯度磁场环境的纳米磁珠分离器是免疫磁珠分离技术中的关键技术之一。设计了一种新颖的环形六孔纳米磁珠分离器,通过瓦状钕铁硼磁块的优化布局和斜壁坡莫合金导磁片设计,实现了在同一台纳米磁珠分离器上形成6个强磁场高梯度分离区域（分离孔）,分离器最高磁场强度达1.44 T,最高磁场梯度达96.3 T/m（体积865.5 cm3,质量4.8 kg）,同一分离器内6个分离孔内磁场分布相同,孔间平均相对偏差在2.0%~3.3%之间。对磁分离孔磁场分布的测试和仿真结果表明：磁珠分离器体积、导磁片材料和导磁片形状等因素对磁珠分离器磁场强度和梯度有不同程度的影响,采用大体积磁块的磁珠分离器比采用小体积磁块的磁珠分离器、采用坡莫合金作为导磁片比采用软铁材料作为导磁片、采用斜壁形状的导磁片比采用直壁形状的导磁片均能实现较大的磁场强度和梯度。该纳米磁珠分离器已成功应用于大肠杆菌和禽流感病毒的免疫磁分离试验研究,并可以根据不同应用需求,组合相关要素以获得理想的免疫磁珠分离器。

微流控生物芯片的磁场仿真及实验对比

近年来,随着生物医学分析和MEMS技术的发展,基于纳米磁珠的微流控生物芯片得到了广泛关注和研究。芯片上的微流路内部集成了微磁场元件,可在外磁场的作用下产生局部梯度磁场,从而将具有特定生物活性的纳米磁珠流捕获,实现后续的生物医学分析。为了有效的捕获磁珠,微磁场元件的外形结构需精心设计,才能产生足够高的磁场强度和磁场梯度。本文利用仿真软件COMSOL(Femlab)对所设计的不同外形的微磁场元件的磁场分布情况进行了仿真分析,随后的在片实验结果与仿真结果吻合得很好。

乙肝前S1抗原的磁性免疫层析检测的影响因素研究

以免疫磁珠作为检测探针,构建了以血清中前S1抗原为标志物的乙肝检测层析试纸条,并重点分析了磁珠粒径、抗体偶联量、p H值、缓冲液和反应温度对该层析检测的影响作用。研究表明,磁珠的分散稳定性对免疫层析检测有显著的影响,因此,磁珠粒径可以作为一项评判其分散稳定性的质控指标。同时,优化抗体添加量,控制层析样本p H值在6.5~9.0之间,并使用p H值更加稳定的PBS基础缓冲液都可以提高层析试纸条检测乙肝抗原的灵敏度和稳定性。可为高灵敏和高稳定性磁性免疫层析试纸条产品的研发提供理论依据。

生物可用型纳米磁珠的制备和改性研究

纳米磁珠在生物医学领域应用日益广泛,但仍存在尺寸不均、分散性差、改性过程中强磁性难以保持和功能化程度偏低等缺点。为克服上述缺点,首先制备尺寸均匀的Fe_3O_4超细强磁核,再先后利用正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷对其进行功能改性,分别得到硅羟基化磁珠Fe_3O_4@SiO_2和氨基化磁珠Fe_3O_4@SiO_2—NH_2,最后研究Fe_3O_4制备及改性过程中其磁性、分散稳定性、功能化程度的影响因素。结果表明,在室温及氮气保护下,氨水量50mL,浓度1mol/L时,Fe_3O_4磁性最强,达到56eum/g,乙醇中稳定分散8d;正硅酸乙酯量0.5mL时,所得硅羟基化磁珠磁性为30eum/g,在乙醇中可稳定分散12d;甲苯中70℃下,所得氨基化磁珠磁性仍有25eum/g,乙醇中可稳定分散14d,且其氨基接枝率达2.306mmol/g,高于文献报道值;因而,该研究所得的改性纳米磁珠具有更好的分散性及更强的磁性,且其表面携带丰富的羟基或氨基活性基团,更易与各种有机活性分子作用,具有广阔的生物医药应用前景。

六种蛋白质与生物纳米磁珠的吸附性能研究

近年来,纳米磁珠在生物技术和生物医学领域受到了广泛的关注,但蛋白质与生物纳米磁珠之间往往存在非特异性吸附,故从蛋白质角度出发,研究不同蛋白质的结构及理化性质与磁珠吸附的关系。利用两种生物纳米磁珠,对6种不同蛋白质与磁珠的吸附特异性展开研究。使用蛋白质分析软件分析各个蛋白结构及蛋白质性质与磁珠吸附特异性的关系。不同的蛋白质与纳米磁珠之间存在非特异性吸附,蛋白大小与磁珠吸附蛋白的能力没有明显关联性。随着蛋白β折叠比例的降低,蛋白质与磁珠的非特异性吸附降低。β折叠比例最大的蛋白——人肿瘤坏死因子-α(TNFα)与磁珠的非特异性吸附最多,可通过吸附获得单一蛋白条带。β折叠比例最小的人膜联蛋白A5(Annexin A5)与磁珠的非特异性吸附最少。当Annexin A5融合增强绿色荧光蛋白(EGFP)后,β折叠比例升高,与磁珠的非特异性吸附增加。不同蛋白质的大小与磁珠的非特异性吸附无明显的相关性,磁珠对蛋白的非特异性吸附能力与蛋白结构的β折叠比例呈正相关,蛋白质的二级结构是影响蛋白质与磁珠非特异性吸附的重要因素。

基于磁固相萃取和液相色谱-质谱联用技术的日本医蛭抗凝活性成分研究

目的使用磁固相萃取、转录组文库及液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)鉴定技术,筛选和鉴定日本医蛭中的抗凝活性成分。方法采用通用合成方法制备凝血酶固定化磁纳米粒,日本医蛭粗提液经磁固相萃取后,洗脱溶液使用高效液相串联三重四级杆飞行时间质谱联用(TripleTOF LC-MS/MS)技术并结合日本医蛭唾液腺转录组文库,进行抗凝多肽的筛选。结果经傅立叶变换红外分光光度计及透射电镜表征,凝血酶成功固定于磁珠上,凝血酶磁珠的酶活性稳定性良好(37℃,19 d,RSD为4.74%);洗脱液经扫描比对含有5种水蛭素变体,均为凝血酶抑制剂,洗脱液冻干粉抗凝活性为70 U·g^(-1)。结论将磁固相萃取、转录组文库以及LC-MS/MS技术相结合成功开发了一种能快速筛选和鉴定日本医蛭中抗凝多肽分子的方法,该方法方便易行,可为动物药活性成分发掘提供参考。

纳米磁珠免疫层析法检测玉米内州萎蔫病菌

基于纳米磁珠标记的免疫层析法,建立快速定量灵敏检测玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis,Cmn)的层析试纸条检测方法。用碳二亚胺(EDC)/N-羧基琥珀酰亚胺(NHS)交联法,使玉米内州萎蔫病菌单抗4G12偶联在纳米磁珠表面上,使用喷膜仪将玉米内州萎蔫病菌单抗4H4和羊抗小鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,基于双抗夹心法原理建立免疫层析试纸条。通过对检测线上超顺纳米磁珠的磁信号进行检测和结果分析,Cmn抗原最低检测限度为1.0×105 CFU/mL,特异性良好且检测时间缩短为5 min。该方法同时可根据检测线的光学反应进行定性判断,具有操作简便、灵敏度高等优点,并可根据磁信号强度定量检测实际玉米种子样品中Cmn的浓度,为植物病原细菌的快速高效检测提供了一种新型的检测方法。

量子点免疫标记法同时检测2种食源性致病菌

目的:建立快速检测金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌的量子点免疫标记方法。方法:利用免疫磁珠富集,量子点标记,微型光纤光谱仪对金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌进行定量检测,建立荧光强度与菌浓度的定量模型,并对捕获条件进行优化。结果:两种目标菌的最佳捕获条件为免疫捕获时间45 min、磁分离时间1.5 min、PBS浓度0.01 mol/L。目标菌浓度在10~2~10~5 CFU/m L范围,目标菌与荧光强度的线性关系为:金葡菌FI=9.2744lg N+50.14,福氏志贺氏菌FI=18.616lg N+53.784,N为目标菌细菌菌落数,CFU/m L;FI为荧光强度值。金黄色葡萄球菌决定系数R^2=0.9626,福氏志贺氏菌决定系数R^2=0.9778,说明具有很好的拟合性。重复性测试结果中相对标准偏差为2.9%,检测时间在2 h内。结论:本文建立的检测方法简单,快速,灵敏度高,特异性好,具有很好的应用前景。