蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及Western印迹两种方法的比较

为了深入了解在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法，采用免疫沉淀法及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析。免疫沉淀结果表明，照射后１７５００、２２０００、２８０００、３２０００、４００００、４３０００及５３０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明，照射后２８０００、３２０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。提示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中，免疫沉淀法优于Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法。

γ射线诱发的白血病小鼠胸腺细胞蛋白质酪氨酸磷酸化水平的变化

目的 :探讨γ射线体外诱发的白血病小鼠胸腺细胞总蛋白质酪氨酸磷酸化水平的变化。方法 :35 3只 BAL B/ c小鼠分为照射组及对照组 ,照射组经 6 0 Coγ射线全身照射后 ,病理证实出现白血病者为癌变组 ,未出现任何肿瘤者为未癌变组 ;对照组为正常 BAL B/ c小鼠 ,未经γ射线照射 ,与照射组同步喂养。分离胸腺细胞 ,应用免疫沉淀法及 Western印迹分析检测蛋白质酪氨酸磷酸化水平。 结果 :癌变组胸腺细胞中蛋白质酪氨酸磷酸化水平总体上明显高于对照组及未癌变组 ,尤以相对分子质量 (4 7.5～ 83)× 10 3及 32 .5× 10 3附近蛋白变化最为明显 ;相对分子质量为 35× 10 3的蛋白在癌变组中酪氨酸磷酸化明显 ,而在对照组及未癌变组中未检测到磷酸化的发生。 结论

应用磷酸化蛋白质组学方法初步研究喉癌相关基因LCRG1的功能

mRNA差异显示技术克隆的喉癌相关基因LCRG1,对不表达该基因的喉癌细胞系(Hep-2)的生长具有明显抑制作用.软件分析推测,LCRG1可能在细胞信号传导中发挥作用.为进一步地研究LCRG1的功能,应用RT-PCR和平板克隆形成实验证实,经多次传代的Hep-2/LCRG1细胞,仍表达LCRG1,且LCRG1具有显著的抑制细胞增殖的能力.抽提Hep-2/LCRG1和Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系总蛋白质,应用固相pH梯度(IPG)双向凝胶电泳(2DGE),结合抗酪氨酸磷酸化抗体的免疫印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS),鉴定酪氨酸磷酸化的蛋白质.得到了分辨率较高、重复性较好的Hep-2/LCRG1和Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系的总蛋白质双向凝胶电泳图谱;结合免疫印迹反应、软件分析和质谱技术识别并鉴定了13个差异反应的酪氨酸磷酸化的蛋白质.这些蛋白质参与了细胞信号传导和细胞代谢等过程.推测LCRG1可能是通过调节这些蛋白质的酪氨酸磷酸化、去磷酸化状态,参与细胞增殖、代谢和凋亡等过程的调控,而发挥抑瘤作用.这为全面、真实地揭示LCRG1抑瘤作用的分子机理提供了新思路.

中华眼镜蛇毒F组份对血小板活化时蛋白酪氨酸磷酸化的影响

目的 :观察中华眼镜蛇毒F组份抑制血小板聚集的胞内信号转导机制。方法 :实验分 6组 :(1)空白组 ;(2 )对照组 ;(3) - (6 )实验组加入浓度为 10 0、30、10、3mg/LF组份。用比浊法测定血小板聚集率。用蛋白质免疫印迹法 (Westernblotting)测定血小板内蛋白酪氨酸磷酸化的表达。结果 :F组份呈浓度依赖性抑制二磷酸腺苷 (ADP)引起的分子量为 76、6 6和 37 5kD蛋白酪氨酸磷酸化的表达 ,其中 30、10 0mg/L给药组中 ,3个分子量蛋白与对照组比较均有显著差异 ,P <0 . 0 5。F组份对ADP引起血小板聚集作用的抑制同降低 76、6 6和 37 5kD 3个分子量蛋白酪氨酸磷酸化的表达呈明显的正相关 (r=0 . 936 7,P <0 . 0 1)。结论 :中华眼镜蛇毒F组份通过抑制分子量为 76、6 6和37 5kD蛋白的酪氨酸磷酸化表达 ,对血小板胞内信号转导过程发生影响 ,可能是其抗栓机制之一。