重组胸腺素α_1的克隆、表达与纯化

目的 利用基因工程方法表达胸腺素α1 (thymosinalpha1,Tα1 )的串联体并进行纯化、鉴定 .方法 将 Tα1 的基因拆分为 4个片段进行合成 ,退火后经 PCR获得串联体基因 ,测序正确后克隆在硫氧还蛋白 (thioredoxin)融合蛋白表达载体 p Thio His A中 ,转化大肠杆菌 TOP10菌株 ,IPTG诱导表达 ,表达的融合蛋白经过 80℃热处理及阴离子交换柱Q- Sepharose Fast Flow进行纯化 ,Western- blot进行鉴定 .结果 获得了纯化的 Thioredoxin- Tα1 3,分子质量约为 31ku.结论 用基因串联思路表达小分子多肽是一种可行的方法 ,Tα1

天然胸腺素α_1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的为降低CNBr裂解融合蛋白的毒副作用 ,改进利用基因重组技术制备胸腺素α1 (Tα1 )的流程工艺。方法按大肠杆菌惯用密码合成Tα1 基因 ,克隆于质粒pGEM 3Zf的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,裂解位点为羟胺裂解位点Asn Gly对应的核苷酸序列 ,测序正确后用BamHⅠ和BglⅡ位点串联为Tα1 4串体 (Tα1 ④ )和Tα1 8串体 (Tα1 ⑧ ) ,经再次测序确认后克隆入pThioHisA的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,转化大肠杆菌TOP1 0。结果经 1mmol LIPTG诱导4h获得了硫氧还蛋白 (thioredoxin)与Tα1 ④和Tα1 ⑧的融合表达 ,用离子交换色谱可纯化出融合蛋白 ,羟胺裂解融合蛋白 ,能够释放出Tα1 单体。结论羟胺能够裂解融合蛋白释放出天然Tα1 。

人胸腺素α_1基因工程菌的构建与表达

胸腺素α1(Thymosinalpha1,Tα1)是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂,临床用途广泛.为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成编码Tα1的基因,克隆于pUCmT,转化E.coliJF1125,经测序证明序列正确后,克隆入pET39(b)的BspT 和BamH 位点,成功地构建出包含信号肽,DsbA,连接肽,6个His,EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys),胸腺素α1的表达载体,转化E.coliBL21(DE3),获得胸腺素α1基因工程菌.SDS-PAGE分析表明,经0.1mmol/LIPTG和30℃诱导8h,在大肠杆菌周质中大量表达表观分子量31kD左右的融合蛋白.为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组胸腺素α1创造条件.

重组人干扰素α2a和GFE-1多肽融合基因的克隆、表达及活性测定

目的:构建IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因表达载体,获得高质量生物产品。方法:应用聚合酶链式反应技术(PCR)对干扰素(IFN)α2a3'端酶切位点进行改造,人工合成编码能特异性高效结合肺组织的GFE-1寡核苷酸片段,二者连接后克隆入pGEM3Zf质粒,进行序列分析,将融合蛋白基因克隆入pBV220表达载体,在大肠杆菌中表达,对IFN-α2a-GFE-1表达产物纯化、鉴定及体外活性检测。结果:利用PCR的方法成功地改造了IFN-α2a3'端酶切位点,成功的将GFE-1多肽与IFN-α2a3'端连接,构建了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白的基因克隆载体pGEM3Zf-GFE-1,DNA测序完全正确。构建了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因原核表达载体pBV220-IFN-α2a-GFE-1,经温度诱导在大肠杆菌中有效表达。纯化了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度大95%,比活性达5.8×109U/mg。结论:IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因的成功克隆、表达、纯化和活性测定,为研制一种具有导向性治疗肺癌、肺纤维化等疾病的有效药品奠定基础。

通用干扰素与胸腺肽融合基因构建与表达研究

临床上将干扰素(IFN)和胸腺肽(THYα1)联合使用远大于各自单独使用的效果,根据细胞因子协同作用的特点,本文通过DNA重组技术将两者构成一个融合基因。本实验用PCR技术将化学合成的胸腺肽α1基因与干扰素基因通过PCR拼接、扩增并克隆到PGEM-T载体中,构建克隆质粒PGEM-IFNTHY。为使IFNTHY基因在原核细胞中表达,克隆质粒经酶切、插入到表达载体pET28 a中。将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经诱导,SDS-PAGE和W esterb lot检测显示,pET28 IFNTHY基因得到了表达;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示表达产物有活性。