云南省芒市蠓虫Tibet orbivirus和Manglie virus的分离及其共感染研究

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)是一种2009年新发现的环状病毒,它对家养动物具有潜在的危害。为了了解云南省西部边境地区芒市蠓虫中TIBOV流行情况,以及在TIBOV和Manglie virus(MaV)共感染情况下,MaV对TIBOV在细胞上增殖的影响。2018年7月我们在云南省德宏州芒市采集蠓虫标本,采用细胞进行病毒分离,获得2株阳性分离物,编号分别为MS18C217-8和MS18C217-9。MS18C217-8株阳性分离物接种C6/36细胞后72h出现细胞病变,细胞病变特点为圆缩、折光性变强和脱落等,而接种BHK-21细胞后168h没有出现明显细胞病变;MS18C217-9株阳性分离物接种BHK-21细胞后72h出现细胞变圆、脱落和破碎等细胞病变,接种C6/36细胞后168h没有出现明显细胞病变。分别采用虫媒病毒特异引物进行RT-PCR,MS18C217-9株阳性分离物TIBOV特异引物扩增阳性,而MS18C217-8株阳性分离物MaV特异引物扩增阳性。测序后,MS18C217-8获得1133个核苷酸序列,MS18C217-9获得1085个核苷酸序列。遗传进化分析结果显示,MS18C217-9株病毒与中国云南、广东、西藏等省、自治区和日本等地区分离的7株TIBOV位于同一进化分支,核苷酸同源性在93.1%~99.2%之间,提示MS18C217-9株病毒是TIBOV;而MS18C217-8株病毒与2011年和2018年云南分离的2株MaV位于同一进化分支,它们之间核苷酸同源性在96.9%~97.3%之间,提示MS18C217-8株病毒为MaV。TIBOV和MaV两种病毒在C6/36细胞上共感染研究结果显示,2种病毒共感染后TIBOV滴度低于TIBOV单独感染病毒滴度,提示MaV可能降低了共感染期间TIBOV复制。本研究首次在蠓虫中分离到MaV,并在同一地点采集的蠓虫中同时分离到了TIBOV和MaV,提示这两种病毒在当地的蠓虫中存在共流行。MaV在媒介中的感染可能会抑制TIBOV复制或传播。该研究结果不仅丰富了我国虫媒病毒种类资源,同时也为阻断动物虫媒病毒病的流行提供新的思路。

1株分离自云南省师宗县库蠓的新型西藏环状病毒

西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)为环状病毒属的新成员,病毒于2009年首次从我国西藏墨脱县采集的圆斑按蚊中分离,目前,对该病毒的认识仍十分有限。本研究对1株分离自我国云南省师宗县库蠓的新型TIBOV毒株YNSZ/V290/2019进行了鉴定,结果表明,病毒可在C6/36与BHK-21细胞上引起明显的细胞病变,电镜下观察,病毒粒子呈球形,直径55~75 nm,具有环状病毒属病毒典型形态特征。电泳结果显示,病毒基因组为十节段双链RNA,呈现“3-3-3-1”的电泳带型特征。对环状病毒属病毒高度保守的基因节段及其编码蛋白(Seg-3/T2)的序列分析显示,YNSZ/V290/2019为TIBOV的成员,与其他TIBOV毒株的核酸与氨基酸序列相似度分别为80.90%~81.70%与97.20%~97.30%。对决定环状病毒属病毒血清型的基因节段及其编码蛋白(Seg-2/OC1)的序列分析显示,YNSZ/V290/2019与已知TIBOV毒株的核酸与氨基酸序列相似度分别为26.90%~30.60%与28.50%~33.20%,表明该毒株可能是一种新血清型的TIBOV。对采集于师宗县牧场的40份黄牛与68份山羊血清进行血清中和试验,结果显示,新型TIBOV在牛、羊的阳性率分别为22.50%与4.41%。新型TIOBV在我国的发现,丰富了我国虫媒病毒的研究,为深入研究我国TIBOV的分布、致病性、感染宿主范围与诊断试剂的开发提供了基础。

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立西藏环状病毒(TIBOV)群特异性核酸检测方法,本研究根据云南师宗新分离的TIBOV(YNSZ/V290/2019)毒株和GenBank中登录的TIBOV毒株VP6基因序列的保守区,设计并合成特异性引物和探针,建立了荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、灵敏性和临床样品的检测。试验结果表明,两种检测方法均可特异性地扩增TIBOV及检出特异荧光信号,而对帕利亚姆血清群病毒(PALV)、蓝舌病病毒(BTV)、流行性出血病病毒(EHDV)、广西环状病毒(GXOV)、阿卡斑病毒(AKAV)、云南环状病毒(YNOV)、非洲马瘟病毒(AHSV)和牛流行热病毒(BEFV)无扩增和无有效荧光信号检出,具有较好的特异性。灵敏性试验结果显示,荧光定量RT-PCR检测TIBOV核酸的下限可达10 copies/μL,常规RT-PCR的检测下限为10~2copies/μL。临床样品检测显示,两种方法均能检测出库蠓样品中的TIBOV核酸,常规RT-PCR扩增产物经测序和BLAST比对分析显示,库蠓样品中检测到的TIBOV与NCBI数据库中TIBOV(DH13C120、XZ0906、D181/2008)毒株VP6基因序列相似度均在95%以上。荧光定量RT-PCR因其更高的灵敏度和实效性,能用于大量临床样品的快速检测,而常规RT-PCR可以对扩增产物进行胶回收测序,进一步了解待测病毒的遗传信息。两种方法相互辅助,可以为TIBOV的早期诊断、快速检测、流行病学调查和实验研究等提供有效的技术方法。

云南省墨江县库蠓中一株西藏环状病毒的分离及全基因组序列分析

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)于2009年首次从中国西藏自治区采集的圆斑按蚊中分离出,目前在中国的云南省、广东省、湖南省和临国日本均有分离报道。2017年我们从云南省墨江县采集的库蠓样品中分离到一株病毒(MJC1-7),接种BHK-21和C6/36细胞后均可产生聚集、皱缩和脱落等明显细胞病变。1%的琼脂糖凝胶电泳显示,病毒基因组为十节段的双链RNA,呈现“3-3-3-1”的带型。通过病毒全长cDNA扩增和测序获取MJC1-7毒株的全基因组核苷酸序列,病毒基因组全长为19260 bp(包括编码区18495 bp和非编码区735 bp),由Seg-1(3950 bp)至Seg-10(832 bp)的10个基因节段构成,可编码6165个氨基酸残基。对环状病毒保守的VP1(Pol)、VP3(T2)和VP7(T13)蛋白氨基酸序列及系统发育分析显示,MJC1-7毒株与TIBOV亲缘关系最近,氨基酸序列相似度为95.4%~99.7%。对决定环状病毒血清型VP2(OC1)蛋白氨基酸序列与系统发育分析显示,MJC1-7与云南(SX-2017a、DH13C120和YN15-283-01)和广东(D181/2008)分离的TIBOV毒株聚为一簇,氨基酸序列相似度为97.3%~98.6%,而中国西藏毒株(XZ0906)和日本毒株(KSB-8/C/09和KSB-3/C/10)形成了另外3个独立的进化分支,MJC1-7与其相似度仅为27.8%~41.8%,以上结果表明MJC1-7毒株与云南和广东毒株有更近的亲缘关系,而中国西藏和日本毒株可能为Seg-2(OC1)基因变异较大毒株。本研究报道了一株TIBOV在我国云南省墨江县库蠓上的分离以及全基因组序列分析,研究结果进一步丰富了我们对TIBOV的认知,为深入研究我国TIBOV的分布、致病性与病原学检测技术提供了基础数据。

云南省西部边境新分离蚊媒病毒分子生物学特征分析

目的分析云南中缅边境地区新分离蚊媒病毒的分子生物学特征，以分析其遗传进化特征。方法2010年1—12月在云南省德宏州芒市和瑞丽市监测点每月一次用诱蚊器采集蚊虫，用BHK-21和C6／36细胞分离病毒，阳性分离物用RT—PCR法进行鉴定及序列测定和分析。结果从采获的7属42种69209只蚊虫中分离到13株流行性乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV），4株盖塔病毒（Getahvirus，GETV），1株西藏环状病毒（Tibetorbivims，TIBOV），7株淡色库蚊浓核病毒（Culexpipienspallensdensovirus，CppDNV）。JEVE基因进化分析证实，新分离的13株JEV均属基因I型，与云南其它地区和邻近省份流行株亲缘关系较近，且抗原和毒力位点未发生明显改变。4株GETVE2基因与云南其它地区分离株同源性高，亲缘关系近。新分离环状病毒的VPl基因与TIBOV亲缘关系最近，而与云南环状病毒（Yunnanorbivirus）存在明显差异。7株CppDNV的NSl基因与以往云南及其他省区流行株具有较高的同源性和亲缘关系。结论首次证实该地区存在基因I型JEV、GETV、TIBOV和CppDNV流行，这些流行株均具有较为稳定的遗传特征和地域特征。

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法在2.31×10^8~2.31×10^2copies/μL质粒标准品浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999;组内与组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为2.31×10^1copies/μL;对蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、盖塔病毒和流行性乙型脑炎病毒检测结果均为阴性,无交叉反应;对云南新分离的9株西藏环状病毒进行检测,拷贝数在3.23×10^5~1.54×10^6copies/μL之间,准确率为100%;对2013年采集自云南江城县的48份牛血液样品进行检测,检出西藏环状病毒阳性3份。结果表明,本研究建立的西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于西藏环状病毒的快速检测,对西藏环状病毒的检测和流行病学调查提供了技术手段。

西藏环状病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)为2009年在我国西藏新发现的一种环状病毒属病毒,本研究拟建立TIBOV可视化RT-LAMP检测方法。根据我国分离TIBOV(YNSZ/V290/2019)毒株Seg-9基因的保守序列设计2对特异性引物,并引入1对环引物,通过反应条件优化,建立了可视化RT-LAMP检测方法,其最佳反应条件为:64℃50 min。利用该方法对流行性出血病病毒、蓝舌病病毒、中山病病毒、广西环状病毒、阿卡斑病毒、版纳病毒、芒市病毒等虫媒病毒的核酸样品进行检测,仅TIBOV能被检测出,与其他虫媒病毒均无非特异性扩增;灵敏度试验显示该方法的最低可检测限制为18.2拷贝/μL,敏感性是常规RT-PCR的10倍以上。应用建立的RT-LAMP和RT-PCR方法分别对2596只蠓虫和蚊虫样品核酸进行检测,结果显示,两者阳性检出率分别为3.31%和1.19%,RT-LAMP检出率是RT-PCR的2倍以上。本研究建立的TIBOV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、快速等优点,为我国开展TIBOV的现场快速检测与流行病学研究提供了有效技术支持。

三带喙库蚊中分离的西藏环状病毒全基因序列测定及分析

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)是环状病毒属中的新成员,首次分离自中国西藏自治区的圆斑按蚊,本研究首次对从三带喙库蚊标本中分离到的西藏环状病毒(HN11121株)进行全基因组序列测定和分子遗传进化分析。结果显示除第2节段以外,三带喙库蚊分离的HN11121病毒株与从圆斑按蚊分离的西藏环状病毒原始分离株(XZ0906)第1~10节段核苷酸和其编码的氨基酸序列长度相同,核苷酸和氨基酸同源性分别为70.3%(S6)~98.7%(S5)和79.8%(S6)~99.8%(S10);而HN11121病毒株与XZ0906病毒株第2节段核苷酸长度分别为2 850bp和2 838bp,分别编码950和946个氨基酸,核苷酸和氨基酸同源性分别为55.8%和47.1%。病毒VP2蛋白氨基酸位点差异结果显示从三带喙库蚊分离的HN11121病毒与从圆斑按蚊分离的XZ0906相比存在390个氨基酸差异位点。基于HN11121病毒株VP1基因和VP3基因核苷酸序列的系统进化分析结果显示HN11121属于环状病毒属西藏环状病毒,但是从三带喙库蚊分离的HN11121病毒与在圆斑按蚊分离的西藏环状病毒原始分离株(XZ0906)处在不同的进化分支。以上结果提示,从三带喙库蚊分离的西藏环状病毒(HN11121)与从圆斑按蚊分离的西藏环状病毒在病毒基因组和病毒基因组分子遗传进化均存在较大差异,鉴于三带喙库蚊是我国乙脑病毒的主要传播媒介,同时该蚊种也是我国南方广泛存在的蚊虫种类,因此加强三带喙库蚊中西藏环状病毒监测对于了解西藏环状病毒的生物多态性具有重要意义。

海南省野生蠓虫西藏环状病毒的研究

目的调查海南省琼中县吸血昆虫及其携带病毒的种类以及流行情况。方法2019年8月在当地吸血昆虫孳生环境(羊圈、猪圈)中,使用“功夫小帅”牌紫外诱蚊灯进行标本采集并使用干冰运输到实验室。采用病毒学和分子生物学方法分离病毒并对病毒分离物进行鉴定。结果共采集到蚊虫3属34只(其中库蚊26只、按蚊1只和骚扰阿蚊7只)和蠓虫(待鉴定)1450只。从采集的蠓虫标本中分离到1株可以引起白纹伊蚊C6/36细胞病变的病毒分离株(HNQZ1927),该病毒不引起金黄地鼠肾细胞(BHK-21)病变。经病毒基因扩增和核苷酸序列测定与分析,结果显示HNQZ1927为10个基因节段的环状病毒属病毒,该病毒基因编码区核苷酸(氨基酸)与环状病毒属中的西藏环状病毒(TIBOV)同源性为79.4%~98.7%(94.6%~100%),而与TIBOV以外的其他环状病毒同源性在1.2%~78.1%。病毒基因组系统进化分析表明,HNQZ1927病毒与我国此前在西藏地区采集的圆斑按蚊中分离的TIBOV XZ0906及我国在三带喙库蚊、致倦库蚊和多种蠓虫中分离的TIBOV处于共同进化分支。结论海南省蠓虫分离的HNQZ1927病毒为TIBOV,这是首次从海南省自然界采集的蠓虫标本中分离到TIBOV。

首次在云南省哨兵牛上分离出一种新型西藏环状病毒

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)为环状病毒属新成员,2009年首次在西藏墨脱县多斑按蚊中发现,目前该病毒对动物健康和公共卫生的危害尚不清楚,本文首次报道了牛体上一株新型TIBOV的分离。2019年在云南省景洪市设置哨兵牛3头,每周采血进行虫媒病毒的监测与病毒分离。监测期的第4周,其中一头牛采集的血液样本接种C6/36细胞盲传3代出现细胞病变,提取病毒核酸进行琼脂糖凝胶电泳,显示病毒基因组为10节段双链RNA,呈"3-3-3-1"的带型特征。电镜观察可见直径约70 nm,具有环状病毒属病毒典型形态特征的病毒粒子,将分离的病毒命名为V298/YNJH/2019。对决定环状病毒种属的基因节段及其编码蛋白(Seg-3/T2)序列分析显示,分离毒株的Seg-3/T2与其它TIBOV毒株的核酸(nt)与氨基酸序列(aa)相似度分别在79.6%~79.9%与96.3%~96.4%之间,其T2蛋白在系统发生树上与其它TIBOV聚为一簇;对决定病毒血清型的基因节段及其编码蛋白(Seg-2/OC1)的序列分析显示,分离毒株与其它TIBOV毒株Seg-2/OC1的序列相似度分别在42.3%~43.4%(nt)与29.3%~31.7%(aa)之间,其OC1蛋白形成独立于其它TIBOV毒株的进化分支,以上结果提示V298/YNJH/2019为一种新血清型TIBOV。通过实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验,对病毒在牛上感染特征的回溯分析显示:在分离到病毒的前一周,动物血液中可检到低水平的病毒核酸,在分离到病毒的当周,血液中病毒核酸含量处于高峰,但两周后检测结果为阴性;动物在病毒感染后第2周开始产生中和抗体,在随后两周达到高峰,在感染后4个月仍保持较高水平。本研究首次报道了一种新型TIBOV在牛体上的分离,丰富了我国流行TIBOV多样性与感染特性的认知,为TIBOV的流行病学、致病性与诊断试剂的研究提供了基础。

云南省德宏州东方库蠓中西藏环状病毒的分离鉴定

目的了解云南省德宏傣族景颇族自治州(德宏州)芒市采集库蠓携带西藏环状病毒(TIBOV)情况及其潜在传播媒介,丰富云南边境地区环状病毒的研究。方法2016年8月在德宏州芒市郊区的牛舍和羊舍用诱蚊灯夜间采集蠓,对采集到的蠓在显微镜下进行初步分类,采用金黄地鼠肾细胞(BHK-21)和白纹伊蚊卵细胞(C6/36)进行病毒分离,阳性分离物分别使用甲病毒属、黄病毒属、TIBOV S7和S10特异引物进行鉴定,对阳性扩增产物测序,采用MEGAⅩ等生物信息软件进行序列分析。同时,提取相应库蠓基因组DNA,采用细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)特异引物鉴定库蠓种类。结果将采集到的库蠓分44批研磨,获得1株可引起BHK-21和C6/36细胞病变的毒株(编号:DHC217-11),接种标本研磨的上清液48 h后,BHK-21细胞出现明显病变;接种标本研磨的上清液72 h后,C6/36细胞出现明显病变。甲病毒属、黄病毒属引物扩增均为阴性,TIBOV S7和S10引物扩增均为阳性,测序后分别获得新分离病毒第7节段(S7)1085 bp和第10节段(S10)723 bp序列。序列分析结果显示,新分离DHC217-11株病毒在S7和S10基因序列构建的遗传进化树上,与6株TIBOV位于同一个进化分支内,它们之间的核苷酸同源性分别为93.4%~99.5%(S7)和81.3%~97.1%(S10),而与蓝舌病毒、鹿流行性出血热病毒等其他环状病毒位于不同进化分支,核苷酸同源性低于62.7%(S7)和58.9%(S10);进一步分析发现新分离DHC217-11株病毒S7基因序列与2013年芒市库蠓分离TIBOV DH13C120株核苷酸同源性最高,为99.5%,S10基因序列与2017年西双版纳傣族自治州分离的TIBOV SX-2017a株核苷酸同源性最高,为97.1%,提示新分离DHC217-11株病毒为TIBOV。采用库蠓COⅠ基因引物对DHC217-11批库蠓进行分子鉴定,序列分析结果显示DHC217-11批库蠓COⅠ基因序列与东方库蠓遗传进化关系较近,它们之间核苷酸同源性最高为99.8%,提示该批库蠓为东方库蠓。结论从云南省德宏州东方库蠓中分离的DHC217-11为TIBOV,东方库蠓可能是TIBOV潜在的传播媒介。

西藏环状病毒TaqMan反转录聚合酶链式反应方法的建立

目的建立一种灵敏、特异的实时荧光定量TaqMan反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),用于快速、准确地检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)。方法收集GenBank数据库中全部TIBOV基因序列,利用Clustal X 2.1软件进行比对,根据分析结果选择TIBOV VP4基因保守区域设计特异性引物、探针;以体外转录的RNA为标准品,建立检测TIBOV的TaqMan RT-PCR方法,绘制荧光定量标准曲线;对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评价。结果引物与探针具有良好的特异性,对多种虫媒病毒无交叉反应。检测反应灵敏度为1.0×10^(2)拷贝/反应,在1.0×10^(2~8)拷贝/反应模板范围内具有良好的扩增曲线,同一样品重复检测循环阈值(Ct)的变异系数均小于1.5%。对西藏自治区、云南省、湖南省和广东省采集的蚊虫样本进行筛查,结果均为阴性。TIBOV模拟样本检出率为100%。结论该方法灵敏度高、特异性强,可用于TIBOV的常规监测。