藏灵菇微生物种群结构的分子特性研究

用PCR—DGGE指纹技术，研究了藏灵菇中微生物多样性及藏灵菇发酵奶发酵过程微生物种群动力学。结果表明，藏灵菇中细菌的种群结构较酵母菌的复杂，不同来源的藏灵菇中细菌种群结构的相似性为78％-84％，酵母菌种群结构的相似性为80％-92％。发酵过程中细菌种群结构变化图谱中的条带B和条带E，以及酵母菌种群结构变化图谱中的条带N贯穿于整个发酵过程，是发酵过程的优势菌。序列分析表明，细菌种群结构的DGGE图谱中的绝大多数条带与乳酸菌相对应，其中最亮条带（条带E）的序列与乳酸乳球菌的相似性为100％。

微囊化纯培养发酵剂发酵奶与藏灵菇奶的比较研究

利用从藏灵菇中分离出的优势菌,进行混合发酵,比较了这种纯培养菌种发酵的酸奶与藏灵菇发酵奶在感官、主要风味成分以及优势菌株数量的差异。HPLC检测结果表明,这2种发酵奶的乳酸产量分别为7.62 g/L和7.85 g/L,无显著差异;GC检测结果表明,微囊化纯培养发酵剂发酵奶中丁二酮的含量明显高于传统藏灵菇奶;GC-MS检测结果表明,2种发酵奶中挥发性风味成分有90%相同;感官评定表明微囊化纯培养发酵剂发酵奶的可接受程度显著高于藏灵菇奶。表明,微囊化纯培养发酵剂发酵奶既保持了藏灵菇奶原有的特征,又在风味上得到了进一步的提高,表明微囊化纯培养发酵剂可以替代藏灵菇进行这类发酵奶的规模化生产。

藏灵菇菌增殖条件及其乳酸发酵特性的研究

对藏灵菇菌增殖条件及其产乳酸特性进行了研究。藏灵菇增殖适宜条件为:乳浓度60%,培养温度28℃,接种量5%,pH值6.6,250 mL三角瓶装液量50 mL,转数100 r.m in-1。连续培养5代后,其增殖率达到108%。藏灵菇产酸能力较强,培养20 h,pH值迅速下降到4.62,酸度增至109°T。外加碳源不利于藏灵菇生长,而添加蛋白胨和酵母浸提物则对藏灵菇增殖有促进作用。

基于Illumina MiSeq高通量技术比较甘肃藏区传统牦牛发酵乳制品细菌菌群多样性

酸牦牛乳、藏灵菇酸奶、曲拉是甘肃藏区藏民们制作的传统乳制品,其中细菌群落对发酵乳品质起到重要作用。本文以甘肃藏区不同藏民家庭制作的传统牦牛发酵乳制品为研究对象,采用Illumina MiSeq高通量测序平台,研究3大类9种传统乳制品中细菌的多样性及群落结构,结合不同样本的菌群群落分布做相关性分析,最终获得511 070条高质量16S rRNA基因序列,共鉴定出5种细菌门、11种细菌属;其中,厚壁菌门及变形菌门为优势菌门,乳杆菌属和链球菌属为各类样品中的高丰度属,其次是球菌属和乳球菌属,不同类型的传统牦牛发酵乳制品具有不同的细菌群落。PICRUSt功能预测表明,基本功能预测占主导水平。本研究结果为进一步研究和保护甘肃藏区传统牦牛发酵乳制品中具有优良特性的细菌,提供理论依据。

雪莲菌发酵对苹果渣膳食纤维结构和功能特性的影响

该文以苹果渣为原料,利用雪莲菌发酵改性苹果渣膳食纤维(dietary fiber,DF),研究发酵温度、接种量、发酵时间3个因素对苹果渣可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber,SDF)的影响。通过单因素试验和正交试验优化确定雪莲菌发酵的最佳工艺条件为发酵温度28℃、接种量7%、发酵时间60 h,测得苹果渣SDF得率为68.28%。通过激光粒度分析仪、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱仪测定发现,雪莲菌发酵制备的苹果渣DF品质更好,雪莲菌发酵对苹果渣DF的功能特性的影响与结构的变化密切相关。

雪莲菌中乳酸菌的益生特性

对分离自雪莲菌的乳酸菌进行益生特性评价。耐酸性和模拟胃肠液耐受性初筛结果表明,20株乳酸菌中有11株乳酸菌在pH 3.0和pH 2.5的培养基中具有耐受性,经过模拟胃肠液培养后有8株乳酸菌的活菌数大于10;CFU/mL;疏水性、自凝聚性、抗氧化能力和抑菌实验结果表明,副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KF2-5和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)RG疏水性较高、抑菌性最强,菌株RG的自凝聚能力和抗氧化能力较强;耐药性实验结果显示,菌株KF2-5和RG对红霉素、卡那霉素、氯霉素和四环素敏感,对头孢噻肟和万古霉素具有耐药性;溶血性实验表明,2株菌均无溶血。本研究筛选得到2株具有益生特性的乳酸菌KF2-5和RG,在益生产品开发中具有潜在的应用前景。

基于气相离子迁移色谱的雪莲菌发酵乳香气与雪莲菌菌群动态变化研究

该文采用气相离子迁移色谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)和高通量测序,分析了雪莲菌发酵乳在发酵过程中的动态香气物质变化、菌群结构以及与香气物质之间的动态变化关系。结果表明,雪莲菌发酵乳有49种香气化合物,发酵第2天出现大量挥发性物质,发酵第8天时,带有良好气味的挥发性物质含量,种类达到峰值,持续发酵时其含量均减少。雪莲菌在发酵过程中乳杆菌占主导地位,随着发酵时间延长,醋酸杆菌丰度逐渐增加。微生物菌群组成的变化对于雪莲菌发酵乳的香气物质有较大的影响,优势菌乳杆菌与苯甲酸甲酯、苯乙酮等呈显著负相关,与异戊醇等呈显著正相关。醋酸杆菌相比乳杆菌对雪莲菌发酵乳的香气影响比较小,与异辛醇、乙酸丁酯、丙酸、2-甲基-1-丙醇等4种物质呈显著正相关。研究结果对雪莲菌发酵乳工业化生产过程中动态调控其香气奠定一定的数据基础。

雪莲菌富硒条件优化及体外抗氧化活性分析

利用雪莲菌吸收和转化无机硒为有机硒,旨在通过优化富硒条件制备菌活性和有机硒占比较高的富硒雪莲菌。针对不同优化需求,确定不同优化指标,从而选择最佳的富硒条件。优化后富硒温度为28℃、富硒时间为24 h、亚硒酸钠添加时间为雪莲菌接种后3 h;通过摇床培养,进行梯度驯化富硒;以透析后总硒含量占比、生物量、富硒率(selenium enrichment rate,SER)和有机硒占比(organic selenium percentage,OSP)确定梯度富硒底物浓度为3、6、9、12、15μg/mL。在最优富硒条件下所制备的富硒雪莲菌的总硒含量(total selenium content,TSC)为(2 194.41±58.49)μg/g,有机硒占比为(84.57±1.45)%。通过抗氧化活性测定发现富硒雪莲菌的抗氧化活性极显著高于雪莲菌(P<0.001)。

西藏开菲尔粒中Lactobacillus kefiri的分离与鉴定

Lb.kefiranofaciens是西藏开菲尔粒中的优势菌株,约占乳酸菌总数的95%。通过分离纯化,构建克隆文库并结合16S rRNA基因测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、菌落PCR和显微镜观察等手段分析了开菲尔粒中的非优势乳酸菌Lb.kefiri。扫描电镜显示,其细胞形态呈短杆状(0.8~1.5×0.6~0.7μm),比Lb.kefiranofaciens短,且细菌聚集生长的趋势更为明显。在所构建的克隆文库中,25个菌落经测序分析,发现有1条序列属于Lb.kefiri。以开菲尔粒为样品,通过分离纯化,应用菌落PCR方法验证的22个单菌落中,有5个单菌落是Lb.kefiri。此外,对开菲尔粒进行PCR-DGGE检测,发现4个开菲尔粒样品中都有Lb.kefiri的存在。这些结果都证明了Lb.kefiri在开菲尔粒中稳定存在且所占比例相对较小,是一种非优势乳酸菌。

西藏开菲尔粒中酵母菌的分离与初步鉴定

西藏开菲尔粒（俗称藏灵菇）是由多种乳酸菌（间或少量醋酸菌）和酵母菌共生而成一种外形酷似菜花的白色或乳黄色团状聚合体,是目前已知的唯一可用于酸奶制作的天然野生菌种资源。采用扫描电镜、分离培养、26S rRNA基因测序与序列分析、荧光原位杂交（FISH）相结合的技术方法,对西藏开菲尔粒中的酵母菌进行了分离培养、鉴定和形态观察。结果显示：西藏开菲尔粒中酵母菌多为球形（2.0~5.0μm）或椭圆形（1.0~3.0×2.0~4.0μm）;从西藏开菲尔粒中分离出的16株酵母菌分属于酿酒酵母属（Saccharomyces）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、亚罗酵母属（Yarrowia）这3个属中的4个种,其中3株是酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）,8株为马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）,3株为解脂亚罗酵母菌（Yarrowia lipolytica）。

基于定量PCR方法初步分析西藏开菲尔粒中细菌与酵母菌数量变化

运用实时荧光定量PCR方法分析西藏开菲尔粒中细菌与酵母菌的数量变化规律,需要有效提取其微生物总基因组DNA。本文通过同时添加溶菌酶与溶壁酶优化实验方案,成功获得西藏开菲尔粒中微生物的总基因组DNA。荧光定量PCR分析提取自培养1、4、8和12周的西藏开菲尔粒的微生物总基因组DNA,结果显示:4个时间点细菌16S rRNA与酵母菌26S rRNA基因拷贝数均分别约为每微升107拷贝与105拷贝,表明细菌与酵母菌的数量相对稳定。该结果为进一步研究西藏开菲尔粒中细菌与酵母菌间的共生关系奠定了一定的基础。

多项分类方法鉴定西藏地区藏灵菇中的乳酸球菌

【目的】采用多项分类法对16株分离自藏灵菇中的乳酸球菌进行准确鉴定。【方法】首先应用传统的生理生化试验,之后采用16S-23S rRNA间区序列多态性分析和变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行了鉴定,最后,通过16S rRNA基因序列分析进行验证。【结果】将16株菌株初步鉴定为3个菌群:片球菌群、乳球菌群和肠球菌群,进一步鉴定为14株耐久肠球菌,1株乳酸片球菌,1株乳酸乳球菌乳酸亚种,16S rRNA基因序列分析验证的结果与前3种试验方法的结果相一致。【结论】试验结果表明传统的生理生化鉴定和16S-23S rRNA间区序列多态性分析和变性梯度凝胶电泳(DGGE)相结合的多项分类方法有利于乳酸球菌种间的准确鉴定。

PCR-DGGE分析西藏雪莲菌细菌多样性

细菌是雪莲菌中的重要功能菌群,对于雪莲菌的形成及其功能作用的发挥有着重要作用,因而探明其细菌的种群特征具有重大意义。本文采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和16S r DNA测序技术对3个西藏雪莲菌颗粒(A、B和C)中细菌多样性进行了研究。DGGE电泳结果显示,样品的丰度值介于12~16之间,细菌多样性指数在1.79~2.11之间,相似性指数在0.62~0.77之间。通过对DGGE指纹图谱优势条带切胶测序结果显示:它们分别属于马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)、气单胞菌属(Aeromonas)和醋酸菌属(Acetobacter)。旨在为雪莲菌微生物资源开发以及加快雪莲菌工业化生产奠定基础。