高糖微环境下糖原合酶激酶3β抑制剂Tideglusib干预大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化

背景:高糖环境能够抑制骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化能力,如何提高成骨细胞在高糖状态下的生物学活性,是改善糖尿病患者种植体骨结合的关键。目的:探究非ATP竞争性的特异性糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)抑制剂Tideglusib在高糖微环境下对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:采用全骨髓贴壁法培养并纯化大鼠骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞分为4组:正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖),Tideglusib+正常对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+20 nmol/L Tideglusib),高糖组(25.5 mmol/L葡萄糖),Tideglusib+高糖组(25.5 mmol/L葡萄糖+20 nmol/L Tideglusib)。①CCK-8法检测细胞的增殖情况;②成骨诱导培养4,7 d后检测碱性磷酸酶的活性;③成骨诱导培养21 d后采用茜素红染色检测钙化结节的形成;④细胞接种24 h后鬼笔环肽染色观察细胞的初期黏附形态;⑤RT-qPCR检测成骨基因Runx2、OPN的mRNA表达,Western blot检测β-catenin和p-GSK-3β的蛋白表达。结果与结论:①Tideglusib(20 nmol/L)不仅显著促进骨髓间充质干细胞的增殖(P<0.05),还能逆转高糖环境对骨髓间充质干细胞增殖的抑制作用(P<0.05);②Tideglusib(20 nmol/L)显著减轻高糖环境对碱性磷酸酶活性的抑制作用(P<0.05),并促进高糖状态下钙化结节产生(P<0.05);③Tideglusib(20 nmol/L)能够改善骨髓间充质干细胞被高糖环境破坏的黏附形态;④与高糖组比较,在高糖环境下Tideglusib(20 nmol/L)可上调成骨基因Runx2、OPN的mRNA表达(P<0.05);⑤与高糖组比较,在高糖环境下Tideglusib(20 nmol/L)可上调Wnt/β-catenin信号通路相关靶点β-catenin蛋白的表达,下调p-GSK-3β蛋白的表达(P<0.05);⑥结果表明,Tideglusib(20 nmol/L)能够通过激活Wnt/β-catenin信号通路从而逆转高糖环境对骨髓间充质干细胞初期黏附形态的破坏以及对细胞增殖和成骨分化的抑制。

Tideglusib对LPS刺激的人根尖牙乳头干细胞牙/骨向分化的影响

目的探讨Tideglusib对LPS刺激的人根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs)的牙/骨向分化的影响。方法分离培养SCAPs,流式细胞术对SCAPs进行表面分子鉴定,检测Tideglusib对SCAPs细胞增殖是否有影响。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和ALP染色筛选Tideglusib促进SCAPs表达ALP活性的最佳浓度。用大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)模拟炎性微环境刺激SCAPs。采用Western blot及实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)等方法检测牙/骨向分化的相关蛋白(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSP、RUNX2)和基因(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSPP、RUNX2)表达变化。结果CCK-8实验显示:Tideglusib浓度低于50 nmol/L时对细胞增殖无抑制作用;1 nmol/L Tideglusib处理LPS刺激的SCAPs,其ALP活性增加最明显;Western blot及qRT-PCR实验显示:1 nmol/L Tideglusib处理后的LPS刺激的SCAPs其成骨/成牙相关蛋白(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSP、RUNX2)和基因的表达(OSX、OCN、COL-Ⅰ、DSPP、RUNX2)均明显上调(P<0.05)。结论1 nmol/L Tideglusib可以促进LPS刺激的SCAPs的牙/骨向分化能力。

GSK-3β抑制剂Tideglusib对成骨细胞增殖与成骨相关基因表达的影响

目的:研究特异性糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂Tideglusib对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖和成骨相关基因表达的影响。方法:采用CCK-8法测定梯度浓度(0~2000 ng/L)Tideglusib培养1、2、3 d时MC3T3-E1细胞的增殖活性,筛选有效浓度;采用荧光显微镜观察有效浓度Tideglusib培养8 h时MC3T3-E1细胞的黏附铺展形态;采用实时定量PCR仪检测有效浓度Tideglusib培养7、14 d时MC3T3-E1细胞中Runt相关转录因子2(Runx2)、Osterix(OSX)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)等成骨相关基因的表达水平,Western blot法检测其Runx2、OCN的蛋白表达水平。结果:与对照组相比,10、20 ng/L浓度Tideglusib具有促进MC3T3-E1细胞的增殖和黏附作用;10、20 ng/L浓度Tideglusib可上调Runx2、OSX、OPN、OCN的基因表达水平,并增强Runx2、OCN的蛋白表达水平。结论:Tideglusib能够促进体外成骨细胞的增殖、黏附以及成骨相关基因的表达。

小分子药物Tideglusib促进大鼠创面愈合的机制研究

目的研究小分子药物Tideglusib对大鼠创面愈合的影响及其机制。 方法选择40只健康雄性2月龄SD大鼠,采用随机数字表法随机分为对照组和Tideglusib组,每组20只,在其背部制作直径8 mm的圆形全层皮肤缺损创面,伤后即刻起,对照组创面滴加50μL磷酸盐缓冲溶液(PBS),Tideglusib组创面滴加50μL 40μmol/L的Tideglusib,1次/d。(1)每组按照随机数字表法选定8只大鼠,分别于伤后3、7、10 d观察创面愈合情况,并计算、比较创面愈合率。(2)每组从未进行创面观察的12只大鼠中选定6只,分别于伤后3、7、10 d取创缘组织,通过苏木精-伊红染色观察创面愈合过程中再上皮化情况、新生毛细血管情况、新生表皮厚度,Masson染色观察真皮胶原纤维排列情况,免疫组织化学染色检测驱动蛋白家族成员14(KIF14)表达水平和分布。(3)将每组剩余的6只大鼠在伤后3 d取创缘组织,经蛋白质印迹法检测蛋白激酶(PKB)、磷酸化蛋白激酶B(p-PKB)、KIF14表达水平变化。对数据行独立样本t检验。 结果(1)相较于对照组,Tideglusib组在各时相点创面明显缩小,创面渗出物更少,炎症反应更轻,肉芽组织质量更好,新生表皮延伸更多;伤后3 d,Tideglusib组创面愈合率为(12.42±3.48)%,对照组创面愈合率为(8.35±1.73)%,2组比较差异无统计学意义(t=1.48,P=0.56);伤后7、10 d,Tideglusib组创面愈合率分别为(33.69±2.18)%、(73.69±3.23)%,与对照组[(21.44±2.11)%、(56.12±3.65)%],比较,差异均有统计学意义(t=5.71、5.08,P=0.01、0.02)。(2)相较于对照组,Tideglusib组在各时相点创面新生表皮层次更多,同真皮连接更加完善,钉突数量更多,且厚度均厚于对照组;伤后3、7、10 d,Tideglusib组新生表皮厚度分别为(15.86±1.78)、(40.42±4.07)、(60.39±7.68)μm,厚于对照组[(6.07±1.12)、(22.25±3.24)、(36.36±6.46)μm],2组比较差异均有统计学意义(t=6.58、4.94、5.36,P=0.003、0.008、<0.05)。相较于对照组,Tideglusib组在各时相点真皮形态更接近于正常大鼠皮肤,胶原更加粗大,排列更加有序,胶原纤维含量更高;伤后3、7、10 d,Tideglusib组真皮胶原纤维含量分别为(16.33±2.35)%、(37.61±3.88)%、(49.72±1.98)%,高于对照组[(7.53±2.99)%、(16.97±3.55)%、(27.06±3.81)%],2组比较差异均有统计学意义(t=3.27、5.55、7.47,P=0.03、0.01、<0.05)。伤后3 d,对照组和Tideglusib组KIF14均主要表达在创缘的表皮和毛囊处;伤后7、10 d,Tideglusib组可在表皮层观察到大量棕黄色KIF14阳性表达,真皮层内也可见棕黄色颗粒分布,而对照组棕黄色颗粒分布稀疏且仅局限于表皮层;伤后3 d,Tideglusib组KIF14免疫组织化学染色平均吸光度值同对照组比较,差异无统计学意义(t=0.994,P=0.344);伤后7、10 d,Tideglusib组KIF14平均吸光度值高于对照组,差异均有统计学意义(t=3.440、2.826,P=0.006、0.018)。(3)伤后3 d,Tideglusib组PKB蛋白相对表达量相较于对照组,差异无统计学意义(P>0.05),p-PKB、KIF14蛋白相对表达量相较于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论小分子药物Tideglusib可加速SD大鼠创面愈合,其机制可能与上调PI3K/PKB/KIF14信号通路有关。

小分子药物Tideglusib通过PI3K/PKB/KIF14通路促进表皮干细胞增殖的机制研究

目的研究小分子药物Tideglusib对表皮干细胞增殖能力和细胞周期的影响及其机制。方法将人表皮干细胞采用随机数字表法随机分为对照组,小分子药物Tideglusib 50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L组,培养48 h后,通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测细胞增殖能力变化(n=6)。通过RNA测序检测转录组水平变化,以P.adj<0.05为差异表达基因筛选标准,分析差异表达基因,并通过基因本体论(GO)富集分析差异表达基因对表皮干细胞生物过程、细胞组成、分子功能的影响(n=3)。通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)验证差异表达基因驱动蛋白家族成员14(KIF14)的转录水平变化,通过蛋白质印迹法和免疫荧光染色验证KIF14蛋白表达水平的变化(n=3)。通过蛋白质印迹法探究蛋白激酶B(PKB)、磷酸化蛋白激酶B(p-PKB)表达水平的变化(n=3)。数据比较采用独立样本t检验,单因素方差分析和Tukey-post-hoc检验。结果培养48 h后,CCK-8实验结果表明,同对照组相比,50 nmol/L组的小分子药物Tideglusib对表皮干细胞增殖能力的影响,差异无统计学意义(P>0.05),100 nmol/L组和200 nmol/L组的小分子药物Tideglusib可明显促进表皮干细胞的增殖(P<0.05)。测序数据显示,同对照组相比,小分子药物Tideglusib 200 nmol/L组共有107个差异表达基因,其中106个表达上调,1个表达下调。GO富集分析表明,差异表达基因主要同有丝分裂与细胞周期相关。通过流式细胞仪检测发现,小分子药物Tideglusib可呈浓度依赖性地提升表皮干细胞进入有丝分裂期的比例,50 nmol/L组的小分子药物Tideglusib对表皮干细胞的细胞周期的影响无统计学差异(P>0.05),100 nmol/L和200 nmol/L的小分子药物Tideglusib可明显提高表皮干细胞处于有丝分裂期的比例,差异有统计学意义(P<0.05)。通过qRT-PCR验证细胞周期相关差异表达基因KIF14发现,小分子药物Tideglusib对KIF14转录的促进作用呈浓度依赖性,50 nmol/L组的Tideglusib即可促进KIF14的转录(P<0.05)。蛋白质印迹法检测证明,小分子药物Tideglusib对KIF14蛋白表达水平的影响呈浓度依赖性,50 nmol/L组的小分子药物Tideglusib即可提高KIF14的蛋白表达水平(P<0.05)。免疫荧光染色表明,小分子药物Tideglusib对KIF14相对荧光强度的影响呈浓度依赖性,50 nmol/L组的Tideglusib对KIF14相对荧光强度的影响无统计学差异(P>0.05),100 nmol/L组和200 nmol/L组的小分子药物Tideglusib可明显提高表皮干细胞KIF14的相对荧光强度(P<0.05)。通过蛋白质印迹法检测KIF14上游蛋白PKB与p-PKB表达水平发现,不同浓度的小分子药物Tideglusib对表皮干细胞PKB的总蛋白水平不产生影响,差异无统计学意义(P>0.05),50 nmol/L组的小分子药物Tideglusib对表皮干细胞p-PKB表达的影响差异无统计学意义(P>0.05),100 nmol/L组和200 nmol/L组的小分子药物Tideglusib可明显提高表皮干细胞p-PKB的表达。结论小分子药物Tideglusib可提升有丝分裂期细胞比例,促进表皮干细胞的增殖,其机制可能与通过上调PI3K/PKB/KIF14信号通路调控表皮干细胞的细胞周期有关。

荧光1,2,4-噻二唑-3,5-二酮衍生物的合成及其对精子的标记作用

合成了3个含有荧光基团的1,2,4-噻二唑-3,5-二酮衍生物,其结构经^(1)H NMR,^(13)C NMR,HR-MS(ESI)表征,并考察了这些衍生物对精子的制动活性和荧光标记作用。结果表明:与先导化合物Tideglusib相比,目标化合物均保持了较强的杀精活性,且在紫外光激发下,具有相似的荧光标记模式。