TNF-α对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肠上皮细胞紧密连接蛋白claudin-1定位和表达的影响,探讨TNF-α增加肠上皮细胞屏障通透性的作用机制.方法:Caco-2细胞(20-30代)应用含有2 mmol/ L谷氨酰胺、20%胎牛血清的DMEM培养液培养7d,细胞生长达到融合后加入不同浓度的TNF-α(0,10,100μg/L)继续培养24h,提取细胞蛋白制备NP-40可溶性及不溶性蛋白框架,Western blot检测磷酸化和非磷酸化的claudin-1蛋白含量,并应用间接免疫荧光法检测claudin-1的定位,实时定量PCR技术检测claudin-1 mRNA的表达.结果:免疫荧光染色可见对照组claudin-1沿细胞膜分布,呈蜂巢状线性荧光,10μg/L TNF-α引起claudin-1荧光信号减弱,并呈锯齿状异常分布;Western blot分析显示claudin-1蛋白有两种表达形式,一种为20 kDa(非磷酸化claudin-1),主要存在于NP-40可溶性蛋白样品中;另一种为25 kDa(磷酸化claudin-1),只存在于NP-40不溶性蛋白样品中.TNF-α不影响20 kDa claudin-1蛋白的表达,但可使25 kDa claudin-1蛋白表达下降且具有浓度依赖性(10,100μg/L:0.31±0.02.0.24±0.05 vs 0.43±0.09 P>0.05,P<0.05);实时定量PCR结果显示不同浓度的TNF-α(10,100μg/L)作用24h或100μg/L TNF-α作用不同时间(4,8和24h)与正常对照组相比均不能引起claudin-1 mRNA的改变.结论:TNF-α对Caco-2细胞紧密连接蛋白claudin-1 mRNA的表达没有影响,但可以引起有功能的磷酸化claudin-1蛋白表达减少.

自然衰老与D-半乳糖诱导的衰老大鼠肠道形态学和上皮紧密连接蛋白表达的对比研究

目的研究自然衰老大鼠和D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠肠道组织形态学、小肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白表达的变化,评估两种衰老模型大鼠肠道屏障结构和功能。方法将大鼠分为26月龄组(A组)、D-半乳糖组(B组)和3月龄组(C组)3组。取各组大鼠回肠组织常规HE染色观察形态学改变,透射电镜下观察肠上皮细胞间紧密连接超微结构,采用Real-time PCR检测小肠黏膜组织中紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)的mRNA表达,采用Western blot检测ZO-1和Occludin的蛋白表达。结果 A组和B组大鼠小肠黏膜厚度及绒毛高度均比C组大鼠降低[小肠黏膜厚度:A组(89.88±6.12)μm、B组(87.62±6.32)μm、C组(162.91±7.28)μm,P<0.05;绒毛高度:A组(59.95±4.47)μm、B组(56.43±5.38)μm、C组(108.12±6.42)μm,P<0.05]。透射电镜下观察到A组和B组大鼠的肠上皮细胞间紧密连接比C组疏松,间隙增宽,密度降低。与C组比较,A组和B组大鼠的小肠组织中ZO-1、Occludin mRNA和蛋白的表达均减少(均P<0.05)。而A组与B组大鼠的小肠黏膜厚度、绒毛高度、小肠组织中ZO-1、Occludin mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义。结论自然衰老大鼠和D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠小肠黏膜结构和上皮屏障功能均受损,小肠黏膜厚度、绒毛高度等肠道组织形态学指标,上皮细胞间紧密连接结构的改变和紧密连接蛋白表达下调等变化具有高度一致性。

双歧杆菌三联活菌对DSS诱导结肠炎鼠肠紧密连接蛋白JAM-1的影响

目的:探讨双歧杆菌三联活菌对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的结肠炎小鼠肠道炎症及紧密连接蛋白连接黏附分子1(junctional adhesion molecule-1,JAM-1)表达与分布的影响.方法:将SPF级♀Balb/c小鼠(8-10周龄)随机分为5组:正常对照NC组、益生菌BB组(正常小鼠予益生菌灌胃14 d)、急性DSS模型组(生理盐水灌胃14 d+第8天起4%DSS溶液自由饮用7 d)、BD组(益生菌灌胃7 d+第8天起4%D S S溶液自由饮用7 d)、B D B组(益生菌灌胃14 d+第8天起4%D S S溶液自由饮用7 d).记录小鼠每日体质量变化.第15天处死小鼠、分离结肠,观察各组肠道损伤情况,以组织病理学积分评估结肠炎的严重程度.采用Western blot法、免疫组织化学法(IHC)检测结肠组织中JAM-1的表达及分布.结果:与D S S模型组相比,益生菌干预组(BD、BDB组)小鼠减轻的体质量得到不同程度恢复(95.17%±3.34%、87.17%±1.83%vs 81.49%±2.16%,P1<0.01,P2=0.08),病变结肠缩短程度、肠黏膜水肿,上皮细胞破坏程度及肠道炎症细胞浸润减轻,且BD组小鼠的改善程度优于BDB组.Western blot结果显示给予益生菌干预,BD、B D B组肠黏膜组织JAM-1蛋白的表达水平较DSS组显著增加(0.725±0.027、0.739±0.033 vs 0.454±0.073,均P<0.05).免疫组织化学结果显示DSS模型组小鼠结肠黏膜JAM-1染色强度明显减弱,染色细胞数减少,分布散乱、中断,益生菌处理后JAM-1染色强度及阳性细胞数减少程度显著改善.仅给予益生菌灌胃的小鼠,体质量、结肠大体、镜下表现以及结肠组织中JAM-1蛋白表达水平及分布,与正常小鼠无显著差异(P>0.05).结论:双歧杆菌三联活菌可能通过影响JAM-1蛋白的表达与分布,改善肠黏膜的屏障功能,从而减轻小鼠急性期肠道炎症反应.

胆管细胞癌来源的外泌体通过内质网应激破坏血管内皮细胞紧密连接实现转移

目的:探讨胆管细胞癌分泌的外泌体对血管内皮细胞紧密连接的影响及其可能的机制。方法:使用超速离心法分离胆管细胞癌CCLP细胞系外泌体并作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC),Western blot、免疫荧光检测内皮细胞的紧密连接。BALB/c裸鼠随机分为PBS组、exo^(CCLP)组及exo^(HIBEC)组并分别尾静脉注射PBS、exo^(CCLP)或exo^(HIBEC)后尾静脉注射FITC-右旋糖酐或CCLP,收集肺及肝脏观察组织内的FITC-右旋糖酐渗漏或肺组织内的肿瘤转移灶。Western blot及PCR检测CCLP外泌体处理的内皮细胞内质网应激相关基因及蛋白水平。予小干扰RNA抑制血管内皮细胞PERK、ATF6或IRE1α,并进一步接受CCLP外泌体作用,观察紧密连接蛋白变化。结果:①CCLP外泌体在体外明显下调HUVEC的紧密连接蛋白水平,增加血管内皮层体外的通透性,并在体内增加裸鼠肺部及肝脏血管的通透性。②经CCLP外泌体预处理后的裸鼠其肺部的肿瘤转移灶数量明显增加,内皮细胞内质网应激相关的基因及蛋白水平均明显增加,予小干扰RNA下调HUVEC的PERK及IRE1α水平能够逆转CCLP外泌体下调的HUVEC紧密连接蛋白而ATF6的敲低并无此作用。结论:胆管细胞癌来源的外泌体能够抑制血管内皮细胞的紧密连接蛋白并增加血管的通透性,从而实现肿瘤转移。这种作用部分是通过引起血管内皮细胞内质网应激实现的。

浆液性和黏液性卵巢囊腺癌患者线粒体结构和紧密连接蛋白表达的差异比较

目的:探讨浆液性卵巢囊腺癌(SC)与黏液性卵巢囊腺癌(MC)细胞线粒体结构及紧密连接(TJ)蛋白occludin/ZO-1表达异常的差异及可能机制。方法:临床确诊30例卵巢囊腺癌患者中15例为SC(SC组),15例为MC(MC组),另选3例子宫肌瘤患者进行对照(对照组)。采用电镜观察各组线粒体超微结构;采用体视学方法分析线粒体面数密度(Nm)、体密度(Vvm)和外膜面密度(Sv);采用免疫组化方法检测各组卵巢上皮细胞occludin/ZO-1蛋白的阳性单位(PU)及其强弱程度(用积分光密度值IOD表示)。结果:电镜下,对照组线粒体及内质网均未见异常;MC组线粒体体积小、数量较多,线粒体Nm、Vvm和Sv较对照组明显降低(P<0.05);SC组线粒体体积大,脊断裂显著,线粒体Nm、Vvm和Sv较MC组显著升高(P<0.01)。免疫组化分析显示MC组occludin和ZO-1PU明显高于对照组(24.23±4.74Vs 21.07±5.51、37.07±3.58Vs 20.46±4.89,P均<0.05),IOD明显低于对照组(72.39±9.86Vs 92.38±7.17、73.51±6.86Vs 80.34±7.04,P均<0.05);SC组occludin和ZO-1PU明显低于对照组(11.50±4.15Vs 21.07±5.51、16.24±3.61Vs 20.46±4.89,P均<0.05),IOD明显高于对照组(101.38±6.16Vs 92.38±7.1、92.78±3.07Vs 80.34±7.04,P均<0.01)。结论:SC及MC两种卵巢囊腺癌患者线粒体结构和体视学特征明显不同,可能与TJ蛋白的occludin/ZO-1表达异常有关。

紧密连接蛋白Occludin与ZO-1在COPD大鼠肺部的表达

目的探索慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)肺泡上皮结构改变的潜在机制.方法建立大鼠COPD模型,于建模第28天,42 d分批处死大鼠,采用免疫组化观察大鼠肺泡上皮紧密连接中闭锁蛋白(Occludin)和闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)的分布和表达.结果 COPD时,42 d实验组肺泡上皮细胞Occludin和Zo-1表达明显下降(P<0.05);28 d实验组肺泡上皮细胞Occludin和Zo-1表达有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05);42 d实验组和28 d实验组相比肺泡上皮细胞Occludin表达明显降低,P<0.05,ZO-1表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 COPD时,紧密连接蛋白表达减少,并随时间的延长,Occludin表达进一步降低,由此证明,Occludin和Zo-1表达与肺泡上皮屏障的破坏密切相关.

CLDN1上调MMP1的表达促进食管鳞癌细胞TE10侵袭及转移

目的:研究紧密连接蛋白-1(tight junction protein 1,CLDN1)在食管鳞癌细胞TE10中的生物学功能及机制。方法:体外构建CLDN1过表达病毒,按感染复数(multiplicity of infection,MOI)=20的比例感染食管鳞癌细胞TE10。通过蛋白质印迹(Western blot)检测CLDN1过表达效果。分别采用细胞增殖及毒性检测试剂(cell counting Kit-8,CCK-8)检测细胞增殖能力,肿瘤细胞迁移及侵袭实验(Transwell)检测细胞迁移及侵袭能力变化。通过基因芯片分析过表达CLDN1对TE10基因表达谱的影响,分析下游靶基因并通过Western blot和回复实验研究CLDN1对MMP1的表达调控。结果:与NC组相比,过表达组TE10细胞中基质金属蛋白酶1(matrix metallopeptidase-1,MMP1)蛋白表达为(2.68±0.10),明显升高(P<0.05);CCK-8实验结果表明,过表达组细胞在24、48、72 h时的吸光度明显高于阴性对照组(P<0.05);迁移实验结果显示过表达组TE-10细胞迁移细胞数明显高于阴性对照组[(54.8±3.4)vs.(24.6±2.1)];侵袭实验结果显示,过表达组TE-10细胞侵袭数目高于阴性对照组[(34.5±2.6)vs.(11.5±1.6)(P<0.05)。信使核糖核酸(messenger RNA,m RNA)芯片分析发现,过表达CLDN1后TE10细胞的MMP1基因表达明显升高(P<0.05),定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)及Western blot证实CLDN1能够促进MMP1的表达;功能回复实验结果显示,干扰MMP1能够抑制CLDN1对TE10细胞的增殖和侵袭转移能力的促进作用。结论:CLDN1可通过上调MMP1的表达促进食管鳞癌TE10细胞的增殖和侵袭转移,发挥癌基因的功能。

解毒护肝颗粒对免疫性肝损伤大鼠炎症因子和小肠紧密连接蛋白的影响

目的:研究解毒护肝颗粒对免疫性肝损伤大鼠炎症因子和小肠紧密连接蛋白的影响。方法:随机将50只SD大鼠分为对照组,模型组,解毒护肝颗粒低、中、高3个剂量(2.7、5.4和10.8g/kg)实验组。除对照组外,其余各组采用腹腔注射猪血清0.5 mL/只,建立免疫性肝损伤大鼠模型。灌胃给药1次/d,连续给药14 d。通过苏木精-伊红(HE)染色法观察肝组织及小肠组织病理变化,检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)。免疫组化法检测肝组织肿瘤坏死因子(TNF-α)和小肠组织occludin-5表达。结果:模型组肝组织出现脂肪细胞堆积,肝细胞增大,肝索排列紊乱,伴炎性细胞浸润;实验组肝细胞形态尚规则,肝索排列整齐,炎性细胞浸润明显减轻。模型组小肠黏膜绒毛萎缩,上皮细胞脱落,水肿明显,大量炎性细胞浸润;实验组黏膜紧密,水肿减轻,浸润的炎性细胞不明显。试验组ALT、AST、LDH和TNF-α显著低于模型组,且随解毒护肝颗粒剂量的增加,试验组ALT、AST、LDH和TNF-α显著降低;而试验组occludin-5显著高于模型组,且随解毒护肝颗粒剂量的增加,试验组occludin-5显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:解毒护肝颗粒可改善肝及小肠的组织结构,保护损伤的肝脏,减轻炎症反应,维持肠黏膜屏障功能。

黄连提取物小檗碱对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜机械屏障的影响

目的观察黄连提取物小檗碱(BBR)对溃疡性结肠炎(UC)小鼠结肠黏膜机械屏障的干预作用,探讨BBR治疗UC的可能机制。方法 BALB/c小鼠随机分为模型对照组、BBR低、高剂量组、阳性对照组和空白对照组。采用右旋葡聚糖硫酸复制UC模型,灌胃给药7 d,评估疾病活动指数(DAI),结肠组织切片、HE染色并观察组织的病理学变化;免疫组化SP法检测紧密连接蛋白claudin-1、occludin和ZO-1的表达水平;Western Blot法测定肠道干细胞(ISCs)标志物LGR-5和TERT的含量。结果与治疗前比较,药物治疗后小鼠的DAI评分均下降(P<0.01),结肠组织病理表现有不同程度的改善;与治疗后同期模型对照组比较,高剂量BBR组的DAI评分显著下降(P<0.01),结肠组织中claudin-1、occludin和ZO-1的水平均明显升高(P<0.01)。BBR低、高剂量组结肠组织中LGR-5和TERT的含量均升高(P<0.05)。结论 BBR通过抑制ISCs和紧密连接蛋白的破坏,维持肠黏膜机械屏障的稳态,从而有效抑制UC小鼠的结肠炎症,对UC的发生发展起到保护作用。