利用TALEN系统对兔进行Tiki1基因敲除

【目的】利用转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)系统获得Tiki1基因敲除的兔模型,为研究Tiki1对动物早期发育作用机理提供兔源的动物模型。【方法】基于TALEN系统设计了靶向兔Tiki1基因的打靶载体,分别将10和50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA注射到原核期的家兔受精卵胞质中,然后收集发育至囊胚期的胚胎,鉴定囊胚率和基因修饰效率,通过测序检验囊胚的基因突变。为了进一步获得Tiki1基因敲除兔,后续将50 ng/μL的Tiki1-TALEN mRNA注射到17个原核期的家兔受精卵胞质中,将受精卵分别移植到2只受体兔体内。【结果】注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚率(64%)与注射10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚率(57%)差异不大,但注射50 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚基因修饰效率(100%)显著高于注射10 ng/μL Tiki1-TALEN mRNA试验组的囊胚基因修饰效率(14.3%)。测序结果表明,Tiki1基因的突变范围从1到28 bp缺失不等。经过胚胎移植共生出3只仔兔,其中有2只兔子能检测到基因突变。【结论】所建立的TALEN技术体系可以对家兔Tiki1基因进行高效的敲除。

利用CRISPR/Cas9系统构建Tiki1基因修饰猪模型

Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因此无法利用小鼠等小动物来研究其在哺乳动物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系统结合体细胞克隆技术构建Tiki1基因修饰猪模型,研究Tiki1基因在猪发育中的作用.我们利用贺熹教授团队提供的人Tiki1基因序列,在猪的基因组数据库中比对出与其同源性最高的一段序列设计2个靶位点(g1和g2).以设计的靶位点构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了52个单细胞克隆株.最终选择靶位点g1为纯合双敲的5个单细胞克隆株和靶位点g2为纯合双敲的3个单细胞克隆株作为构建Tiki1基因敲除猪的核供体.我们共计构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,其中有1头经B超检测成功怀孕并妊娠到期产下13头发育正常的克隆猪,经测序鉴定其中12头为Tiki1基因双敲除猪模型,Tiki1基因敲除克隆猪健康存活至今.结果表明Tiki1基因对于猪早期发育的作用机理不同于蛙,其在猪早期发育的过程中的具体作用机理有待后续进一步的深入研究.

利用CRISPR/Cas9系统构建TiKi1和TiKi2双基因敲除兔

Tiki基因为新发现的基因,在蛙上的功能研究证实Tiki在头部诱导的过程中起着决定性的作用。由于TiKi基因包含TiKi2和TiKi1两种类型,因此建立一种同时敲除TiKi2和TiKi1两种基因的兔模型,能更好地研究TiKi基因是否影响兔头部的早期发育。本研究通过CRISPR/Cas9系统结合原核期受精卵RNA胞质内显微注射来建立家兔双基因打靶技术体系。考虑到TiKi1和TiKi2的同源性比较高,可能相互之间存在补偿效应,于是设计了一个gRNA能同时靶向TiKi1和TiKi2。将200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA注射到51个处于原核期的家兔受精卵的胞质内,移植到6只受体兔体内,共计生出12只仔兔,经测序鉴定其中有1只仔兔为TiKi1和TiKi2双等位基因敲除模型。结果表明CRISPR/Cas9系统对于家兔双基因修饰研究是一种高效和简便的工具,成功建立的TiKi1和TiKi2双基因敲除兔模型在评估新药疗效、基因治疗等的研究领域中将具有很大的应用潜力。