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黄瓜基于扩增子测序的TILLING技术体系的建立

定向诱导基因组局部突变(TILLING)技术能够对突变群体中的点突变进行快速筛选,而样品混池深度是影响其效率的主要因素。为提高TILLING的突变检测效率,本研究以甲基磺酸乙酯(EMS)诱变群体构建的突变体库为基础,对其中部分M2代植株进行突变性状观察,结果表明表型突变率为10.80%。同时利用已知矮化突变体与野生型进行混池,分别构建96、192、288、384四个不同深度的测序池,使用GATK软件进行突变检测,为对假阳性位点进行有效过滤,候选突变位点分别根据突变类型及归一化深度作为阈值两次进行过滤。结果表明,96~288倍的混池深度均能稳定检出预设的已知突变位点,并与Sanger测序结果相一致。与前人相比,本研究通过优化混池深度与过滤阈值,实现了更高混池深度的突变检测,并在黄瓜中建立了基于扩增子测序的TILLING技术体系,可实现更高通量地对大规模突变群体进行目标突变的鉴定。

用于水稻突变体大量筛选的DNA微量快速提取法

介绍了一种高通量水稻DNA微量快速抽提法。该方法特别适用于精细作图群体和大型突变体库的筛选鉴定,不仅通量大、速度快,而且可以确保足够的DNA浓度和纯度。DNA质量可以确保一般的PCR扩增,包括SSR检测以及应用于TILLING(targetinginducedlocal lesionin genome)分析。

CELⅠ酶的粗提取及其活性检测

CELⅠ酶是第一个从真核生物中提取的用于高效特异切割DNA双链碱基错配和DNA扭曲的内切酶,因而也是TILLING技术中用到的一种关键酶。文章对CELⅠ酶的粗提取及其活性检测进行了研究。错配切割实验表明,CELⅠ酶在包含有G→A点突变的杂合双链中,能有效地在错配位点进行切割,并可以通过ABI377测序仪获得直观的检测结果,从而可以用于TILLING分析。

EMS诱发小麦京411突变群体构建及Wx-A1基因突变体鉴定

为扩大小麦突变群体类型,提高目的基因点突变挖掘效率,选用北部冬麦区骨干亲本京411为材料,利用甲基磺酸乙酯（ethyl methylsulfonate,EMS）化学诱变剂构建小麦突变群体,以Wx-A1为候选基因,用TILLING技术检测所创建的突变群体。结果表明,0.90%EMS溶液处理8 h和1.50%EMS溶液处理4 h均能获得较好的损伤效果,致死率分别达到38.47%和56.00%;在此基础上创建了包含867个株系的M2突变群体,在该群体中获得Wx-A1基因的7个点突变,突变密度为1/67.0 kb;其中预测有功能变异的4个错义突变系均可以稳定遗传至下一代,其直链淀粉含量降低2.8%~7.4%。本研究所构建的小麦突变群体可以作为其他目的基因的TILLING检测材料,用于小麦目的基因突变挖掘及功能基因组学研究。

TILLING技术的原理、特点及其在点突变筛选中的应用

TILLING(TargetingInducedLocalLesionsINGenomes),是一种全新的反向遗传学研究方法,它提供了一种高通量、低成本规模化高效筛选化学诱变剂EMS诱发产生点突变的技术。本文简要介绍了TILLING的原理和技术优势,并对其在植物功能基因组学、突变分子育种和预测突变频率中的应用作了初步探讨。

TILLING技术的形成和发展及其在麦类作物中的应用

TILLING(Targeting induced local lesions in genomes,定向诱导基因组局部突变技术)是一种高通量的等位变异创制和突变体快速鉴定技术,其实质是将传统的化学诱变方法和突变的高效筛选有效结合的反向遗传学研究方法。其技术原理是将传统的酶切技术与PCR技术相结合后采用红外双色荧光系统进行结果鉴定,从而筛选出相应的突变体。传统的TILLING技术主要用于筛选由人工诱导产生的突变体。Ecotilling技术由TILL-ING技术延伸而来,主要用于鉴定自然界中已经存在的突变体,其与传统的TILLING技术的区别主要为构建DNA池时略有差异。随着该项技术在拟南芥等模式植物中的成功应用,越来越多的人开始将其用于基因组较大的植物之中。本文对近年来TILLING技术在麦类作物中的应用进行了分析,并通过比较不同植物突变体库中的突变频率发现,经EMS处理的小麦等麦类作物突变体库中的突变频率显著高于其他植物,因此相信,TILLING技术将会作为一种常规手段在麦类作物尤其是普通小麦改良中得到越来越广泛的应用。

TILLING技术在作物突变研究中的应用现状与前景

定向诱导基因组局部突变(targeting induced local lesions in genomes,TILLING)技术将化学诱变与高通量突变检测技术相结合,可高效、快速地从突变群体中鉴定出目标基因突变位点。本文在概述TILLING技术应用于水稻、小麦、玉米、大豆等作物突变研究现状的基础上,重点综述了TILLING分析群体构建与突变位点检测方法的技术改进与发展,探讨了TILLING技术目前存在的问题与前景。

大麦EMS突变群体的创建及功能评价

为开展麦类作物功能基因组学研究,选用综合性状突出的大麦品种Tamalpais,通过化学诱变剂甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate,EMS)处理,创建了含有10 389个M2单株的突变群体。该群体数据分析表明,温室条件下,6.21%的M2幼苗呈现叶片颜色变异;大田实验中,M2群体出现丰富的表型变异,主要包括幼苗匍匐、分蘖、株高、生育期、叶色、叶形、叶条纹、叶斑、穗部特征、育性等,其中幼苗匍匐、分蘖、株高、叶色、叶条纹、叶斑的突变频率分别为0.11%、6.03%、0.13%、2.5%、0.18%、0.17%。抽样调查显示,M2世代的胚坏死率较低,仅有9%左右的单株表现出过半的胚坏死率。运用TILLING技术成功获得大麦COI1同源基因的突变体,筛选结果同时表明,该突变群体的突变频率约为平均每673kb一个点突变。因此,Tamal-pais群体突变表型丰富、TILLING检测可行,可作为麦类作物基因图位克隆与功能验证的重要素材,适用于麦类作物的正向和反向遗传学研究。

家蚕化学诱变剂及诱导突变体的筛选

在家蚕Bombyx mori基因组计划完成之后,其功能基因组研究成为该领域的最重要课题。突变体是功能基因组学研究的重要材料,因此,通过人为诱导获取大量的突变系统是及其重要的手段。本研究用化学诱变剂ENU、MNU、DES、5-BU、EMS诱导处理家蚕标准品种C108,筛选获得了非滞育红卵,长圆筒茧、小茧、丝胶茧及绵茧突变体,致死突变体及无鳞毛蛾翅突变体。结果还表明:MNU、DES诱变家蚕的突变效率高,注射翅原基比腹部更方便且效果好,化学诱导雄体比雌体的效果好;在时期上,注射蛹和蛾都有诱导效果。上述突变体大多为致死性突变,推测其可能与致死性基因突变有关。同时,本研究为应用TILLING技术鉴定家蚕更多目的基因突变体提供了有效的材料。

TILLING技术的发展及其在不同植物中的应用

TILLING技术(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)经过十多年的快速发展,已经应用到多种植物点突变高通量筛选与基因功能研究中,检测方法也逐渐趋于多样化,直接测序、毛细管电泳、高分辨熔解曲线等检测方法均得到了较多的应用。与此同时EcoTILLING、DeTILLING及iTILLING等相关技术的发展扩大了TILLING技术的应用范围。本文着重介绍了目前TILLING分析中用到的不同检测方法及相关生物信息学工具,详细评述了TILLING技术在模式植物、主要粮食作物、油料作物、蔬菜等其它作物中的应用与研究进展。

TILLING技术的原理与方法述评

TILLING,即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes(定向诱导基因组局部突变技术),是由美国Fred Hutchinson癌症研究中心Steven Henikoff领导的研究小组发展起来的,是一种全新的反向遗传学研究方法。TILLING技术借助高通量的检测手段,快速有效地从由化学诱变剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变。目前,TILLING已被应用于多种生物的研究中。本文系统介绍了TILLING技术的基本原理、技术路线及其技术优势,同时列举了TILLING的应用实例,并展望了TILLING技术的应用前景。

植物功能基因组研究方法及进展

随着植物功能基因组研究的深入,T-DNA标签、转座子标签、反义RNA技术、基因敲除、基因陷阱和TILLING技术等多种研究方法获得了建立,并随着植物功能基因组学的不断发展而进一步完善。综述了各类研究方法的原理,并对这些方法的优缺点进行了比较与分析。

小麦TILLING分析中CELⅠ酶切及PCR反应体系的优化

在小麦中建立稳定的基于CELⅠ酶切的目的基因突变位点检测技术,有助于高通量鉴定目的基因片段的点突变及提高突变检测效率。本研究以冬小麦品种新麦18空间诱变SP2群体为材料,以小麦糯质基因Waxy为目标片段,通过优化基因组DNA提取方法、调整PCR反应体系中dNTP、Mg2+及引物浓度、改变目标片段CELⅠ酶切缓冲液成分,以及调整纯化过程中的空气相对湿度等方式,优化了小麦TILLING技术体系。在利用PVP-40法提取DNA过程中,研磨器振动频率提高到30/s,KAc溶液的反应时间延伸为20min时,基因组DNA质量和纯度最佳;在设定的浓度范围内dNTP和Mg2+浓度对产物影响差异不明显,均能高效扩增出目的条带。引物浓度对产物影响差异显著,最佳引物浓度为0.4μmol/L。20μl酶切体系中,最佳CEL I酶浓度为0.1U且利用超纯水代替CELⅠ缓冲液。最终在小麦中建立起了基于CELⅠ酶切的高通量TILLING筛选技术体系。

TILLING技术在植物功能基因组及育种中的应用(英文)

随着拟南芥、水稻等模式植物基因组测序计划的全面完成,数据库中大量的DNA序列需要进行功能注释,而用传统的正向遗传学进行基因克隆和近年来发展的反向遗传学(如插入突变、反义RNA、RNAi等技术)方法已不能适应基因组学的发展需求,因此,研发大规模、高通量的基因功能分析方法成为当务之急。TILLING技术(Targetinginducedlocallesionsingenomes)就是在基因组生物学大背景下出现的一种全新的反向遗传学技术。TILLING技术的基本步骤是通过化学诱变方法产生一系列点突变,经过PCR扩增放大和变性复性过程产生异源双链DNA分子,再通过特异性酶切和双色电泳分析识别异源双链中错配碱基,从而检测出突变发生的准确位置。由于具有高通量、大规模、高灵敏度和自动化等特点,能够适应植物功能基因组学研究的要求,TILLING技术已经和即将在功能基因组领域发挥越来越重要的作用。TILLING技术应用于已测序完成的拟南芥和水稻中的突变位点检测并取得了巨大成功;TILLING技术应用于农作物的品种改良,可以帮助实现快速、定向改良作物的品种,同时由于TILLING采用的化学诱变技术与传统诱变育种并无二致,因此在作物改良中采用TILLING技术不存在外源基因转入引发的转基因作物(GMO)争论;由TILLING技术发展来的EcoTILLING技术,具有通量高、成本低、定位准确等优点,可以很好地进行多态性检测和研究基因的功能,已成为开展物种DNA多态性检测和不同物种演替进化研究的有力工具。本文简要介绍了TILLING的原理及操作步骤,讨论了TILLING技术的特点和优点及TILLING技术的应用前景。

TILLING技术在作物品质改良中的应用

TILLING(定向诱导基因组局部突变)技术是近年来发展起来的一种全新的反向遗传学技术,它能高通量、低成本地在EMS诱变群体中鉴定出发生在特定基因上的点突变,已广泛应用于植物功能基因组学的研究。TILLING作为一种诱导并鉴定新的遗传变异的非转基因的反向遗传学研究方法,可在影响作物关键性状的基因中诱导并鉴定新的遗传突变,已经开始应用于作物的品质改良。

烟草镉转运基因突变体的鉴定和功能分析

为获得对镉吸收能力下降的烟草材料,通过TILLING技术筛选出镉转运基因NtHMA2的突变体并测定了该突变体中镉及其他重金属的含量。结果表明,在镉胁迫下,与对照相比突变体烟叶中的镉含量降低36.84%;锌、铬、镍、砷、铁含量分别降低27.92%、32.48%、30.18%、11.33%、30.51%。突变体株高比对照显著降低,其他农艺性状无显著差异。获得的对镉吸收能力下降的突变体材料hma2-23可用于烟草抗镉胁迫品种的培育。

TILLING技术研究进展及其在植物空间诱变上的应用前景

在回顾TILLING/ecoTILLING技术的发展及其应用的基础上,阐述了其在植物空间诱变研究领域的应用前景。

Tilling技术及其在遗传学中的应用

Tilling技术是近年来发展起来的一种用于检测点突变的新方法 ,由于该技术通量高、实验成本低、高效快捷 ,目前已被广泛应用于农业研究中。随着Tilling技术的不断发展 ,它将成为遗传学领域中 ,特别是功能基因组研究中发现基因多态性和大规模筛查基因突变的有效手段。

TILLING技术及其应用

定向诱导基因组局部突变(targetinginducedlocallesionsingenomes,TILLING)可快速、有效地鉴定和定向筛选突变,是一种全新的反向遗传学技术。现对TILLING的技术流程、核心与特点,及其在突变研究、反向遗传学及功能基因组学、SNP检测、资源创新与分析以及作物遗传改良等方面的应用进行了综述。