下调Tim-3对肝癌干细胞自我更新能力及Wnt信号通路的影响

目的探讨Tim-3对肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)自我更新能力及Wnt信号通路的影响.方法培养人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721及正常干细胞系L02,流式细胞仪分选Nanog阳性(+)的肝癌干细胞;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Tim-3在3个细胞系中的mRNA表达水平及在肝癌干细胞中的mRNA表达水平;HepG2肝癌干细胞转染Tim-3 siRNA,荧光显微镜和光学显微镜检测转染率,Western blot法检测转染后Tim-3蛋白水平;qRT-PCR检测转染前后Tim-3、Wnt3、β-catenin的mRNA表达水平;细胞克隆形成试验和细胞成球试验检测转染前后HepG2肝癌干细胞的自我更新能力的变化.结果 qRT-PCR检测Tim-3在肝癌细胞系HepG2、SMMC7721中的mRNA表达显著高于正常肝细胞L02(P<0.05);Tim-3在HepG2肝癌干细胞的表达明显高于肝癌细胞(P<0.05);在SMMC7721肝癌干细胞与肝癌细胞比较Tim-3mRNA表达有低趋势;经荧光镜和光学显微镜观察,Tim-3 siRNA转染细胞良好;Western blot法结果表明,Tim-3蛋白水平在siRNA-451组细胞中的表达显著低于siRNA-750、siRNA-NC、未转染细胞(P<0.05);转染后HepG2干细胞Tim-3、Wnt3、β-catenin的mRNA表达水平均显著下降;克隆形成实验和细胞球形成实验显示转染Tim-3 siRNA后,细胞的克隆形成能力和细胞球生长能力均显著降低(P<0.05).结论下调Tim-3表达水平后,可通过抑制Wnt信号通路,最终减弱肝癌干细胞的自我更新能力.

Tim-3对肝癌干细胞自我更新能力的调控以及对TGF-β1/smad4通路的影响

目的:探究T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)在肝癌干细胞自我更新中的调控作用以及对转化生长因子-β1(TGF-β1)/smad4通路的影响。方法:体外培养肝癌细胞Huh7,获取肝癌干细胞,免疫印迹(WB)法检测肝癌干细胞标志物表达,包装si-Tim-3慢病毒载体感染肝癌干细胞分为空白组、si-NC组(添加阴性序列病毒)和si-Tim-3组,CKK-8法检测细胞增殖情况,光镜计数法检测细胞成球率,平板细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成情况,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室检测细胞侵袭能力,WB法检测细胞中TGF-β1、smad4蛋白表达。结果:与肝癌细胞相比,肝癌干细胞标志物白细胞分化抗原133(CD133)、CD90、上皮细胞黏附分子(Ep CAM)蛋白表达显著升高(P<0.05)。与空白组和si-NC组相比,si-Tim-3组细胞增殖抑制率、迁移抑制率和Smad4蛋白表达显著升高,成球率、克隆形成率、侵袭数量和Tim-3、TGF-β1蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:抑制Tim-3表达后可抑制肝癌干细胞增殖、侵袭、迁移,其机制可能与下调TGF-β1、上调smad4蛋白有关。

高转移潜能肝癌HCCLM3细胞中侧群细胞的分离及其干细胞特性鉴定

目的:检测高转移潜能肝癌HCCLM3细胞株中侧群(side population,SP)细胞比例,分选SP细胞并探讨其生物学特性。方法:4种肝癌细胞株的转移潜能大小依次为HCCLM3>MHCC97H>MHCC97L>Huh7,分别予以荧光染料Hoechst33342染色,以加入维拉帕米的拮抗组为对照,流式细胞术检测SP细胞比例;从HCCLM3细胞中分选SP细胞和主群(main population,MP)细胞,采用悬浮球培养、Transwell侵袭实验及裸鼠成瘤实验判断HCCLM3 SP细胞是否具备肿瘤干细胞生物学特性;RT-PCR检测SP及MP细胞中干细胞相关基因的表达。结果:HCCLM3细胞中SP细胞比例为(16.9±1.8)%,显著多于MHCC97H、MHCC97L、Huh7中SP细胞比例[(8.4±0.7)%、(4.6±0.5)%、(1.0±0.2)%,均P<0.05]。HCCLM3细胞中,SP细胞悬浮球形成明显高于MP细胞[(25.3±5.1)%vs(11.2±2.6)%,P<0.05],SP细胞的侵袭能力显著高于MP细胞(P<0.05),SP细胞的裸鼠皮下成瘤能力也明显高于MP细胞。HCCLM3细胞的SP细胞中干细胞相关基因ABCG2、CD13、CD44、Nanog、Sox2及Klf4 mRNA平均表达水平分别是MP细胞的5.64、2.26、2.10、3.78、2.37、2.92倍(均P<0.05)。结论:肝癌HCCLM3细胞的SP细胞中富集了肝癌干细胞,这可能与其较高的转移潜能有关。

黄芩素能下调诱捕受体3表达抑制肝癌干细胞的生物学行为

背景:目前尚未见有关以肝癌干细胞为靶向的中草药抗肝癌机制的报道,因此有必要展开相关研究。目的:探讨黄芩素对肝癌干细胞诱捕受体3表达的影响,以及下调诱捕受体3表达对肝癌干细胞生物学行为的影响。方法:按照课题组之前建立的技术方法,从肝癌细胞株(购自中国科学院上海细胞库)中获得肝癌干细胞。将肝癌干细胞分为黄芩素高、中、低剂量组以及对照组,黄芩素高、中、低剂量组分别用含200,100,50μmol/L黄芩素的L-DMEM培养基培养,对照组仅用L-DMEM培养基培养。采用RT-PCR、Western blot检测黄芩素处理后诱捕受体3 mRNA和蛋白表达变化,采用CCK8法、流式细胞术、Transwell法检测肝癌干细胞增殖、细胞周期分布、凋亡和迁移情况。结果与结论:①与对照组相比,高剂量黄芩素能显著下调肝癌干细胞诱捕受体3的mRNA和蛋白表达,因此确认高剂量黄芩素为最佳作用浓度;②与对照组相比,高剂量黄芩素组肝癌干细胞的增殖能力明显下降,S期和G2期细胞比例增加,而G1期的细胞比例则减少(P<0.05);③与对照组相比,高剂量黄芩素组肝癌干细胞的凋亡率明显增加,迁移能力明显下降;④结果表明,高剂量黄芩素能通过下调肝癌干细胞的诱捕受体3表达而抑制细胞的一系列生物学行为,为临床上以诱捕受体3为靶点,以肝癌干细胞为对象进行肝癌治疗提供了实验依据。

人脐带间充质干细胞通过IL-6/STAT3信号通路促进肝癌HepG-2细胞的增殖

背景:人脐带间充质干细胞能分泌多种细胞因子,参与调控肿瘤的增殖、转移及血管生成等生物学行为,其中白细胞介素6可能是最重要的炎性因子之一。目的:探讨人脐带间充质干细胞通过IL-6/STAT3信号通路对肝癌HepG-2细胞增殖和迁移的作用。方法:采用ELISA法检测人脐带间充质干细胞和肝癌HepG-2细胞中白细胞介素6的表达量。Western blot法检测肝癌HepG-2细胞内STAT3以及p-STAT3蛋白质的表达水平。RT-PCR法检测PCNA、Cyclin D1、Survivin、STAT3基因的转录水平。细胞计数法和CCK-8法检测肝癌HepG-2细胞的增殖能力。划痕实验和Transwell实验检测肝癌HepG-2细胞的迁移能力。结果与结论:(1)人脐带间充质干细胞白细胞介素6表达量明显高于肝癌HepG-2细胞(P<0.05);(2)人脐带间充质干细胞的条件培养基和白细胞介素6均能激活STAT3,白细胞介素6中和抗体则明显削弱了人脐带间充质干细胞条件培养基的激活作用;(3)用白细胞介素6中和抗体或AG490抑制STAT3的活性后,肝癌HepG-2细胞的增殖相关基因PCNA、Cyclin D1、Survivin的m RNA表达水平明显下调,其增殖和迁移能力明显下降;(4)结果表明,人脐带间充质干细胞能分泌白细胞介素6激活STAT3信号通路促进肝癌HepG-2细胞的体外增殖和迁移。

IGF-FOXO3a通路对肝癌干细胞自我更新能力的调控

目的探讨FOXO3a对肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)自我更新能力的调控作用以及其相关机制。方法流式细胞仪分选获取肝癌干细胞,实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测FOXO3a在肝癌干细胞中的表达情况;利用类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor,IGF)的抑制剂或激活剂改变IGF活性,Western blot和qRT-PCR检测FOXO3a表达的改变;包装、纯化表达和干扰FOXO3a的慢病毒并进行细胞的感染,Western blot检测其过表达和干扰效率;采用细胞克隆形成实验和细胞成球生长能力实验检测过表达或干扰FOXO3a后细胞自我更新能力的改变,以及肝癌细胞中激活IGF信号,同时过表达FOXO3a后细胞自我更新能力的改变。结果 FOXO3a在肝癌干细胞中的表达明显低于肝癌细胞(P<0.01),并且受到IGF的负向调控;构建了稳定过表达和干扰FOXO3a的细胞模型,并发现过表达FOXO3a后,细胞的克隆形成能力和成球生长能力均降低,而干扰FOXO3a后,细胞的克隆形成能力和成球生长能力均得到了提升;激活IGF信号,同时过表达FOXO3a后,细胞的克隆形成能力和成球生长能力下降。结论 FOXO3a对肝癌干细胞的自我更新能力具有负向调控作用,且可受到IGF的负调节,并介导IGF对肝癌干细胞的自我更新能力的调控。

亲缘HLA单倍体相合外周血造血干细胞移植后Tim-3/Galectin-9通路变化特点及临床意义

目的探究Tim-3/Galectin-9负性信号通路在亲缘HLA单倍体相合外周血造血干细胞移植中的变化特点及其临床意义。方法以行单倍体造血干细胞移植的36例患者和20例健康者为研究对象,通过FCM监测患者及健康对照组外周血中CD4^(+)T细胞和Tim-3分子的表达情况,ELISA法检测移植后患者细胞因子Galectin-9、IFN-γ、IL-4、TGF-β和IL-17的动态变化。结果根据西雅图国际诊断标准,移植术后有14例患者发生aGVHD,22例患者未发生aGVHD。①未发生aGVHD患者移植后30~90 d CD4^(+)T细胞百分比均低于健康对照组(P<0.05);未发生aGVHD患者移植后血清中细胞因子Galectin-9、TGF-β、IFN-γ、IL-4和IL-17水平呈现逐渐增高的趋势,Galectin-9和TGF-β水平在移植后60 d达到正常值(P>0.05),IFN-γ、IL-4和IL-17在移植后第90天恢复到正常水平(P>0.05)。Spearman相关分析结果显示Galectin-9与TGF-β变化水平呈正相关(r=0.651,P=0.001);②发生aGVHD患者外周血中Tim-3^(+)CD4^(+)T细胞的百分比和IFN-γ、IL-17水平明显高于不发生aGVHD患者(P<0.01);不发生aGVHD患者的Galectin-9和TGF-β水平更高(P<0.05)。Spearman相关分析结果显示Tim-3^(+)CD4^(+)T细胞的百分比与IFN-γ水平呈正相关(r=0.631,P=0.015)。结论单倍体相合外周血造血干细胞移植后细胞因子Galectin-9和TGF-β的早期快速重建可以避免或减缓aGVHD的发生,移植后动态监测Tim-3^(+)CD4^(+)T细胞持续较多而血清中Galectin-9水平下降可能预示着aGVHD的发生。

中药复方敷和备化方对CD133^(+)HepG2肝癌干细胞增殖及相关自噬蛋白影响的机制

背景:肝癌干细胞是肝癌不断发生发展和高异质性产生的关键细胞,目前尚无针对肝癌干细胞相关自噬通路为靶点的中药复方研究,因此中药复方抑制肝癌干细胞自噬的研究十分具有必要性。目的:探讨中药复方制剂敷和备化方对CD133^(+)HepG2肝癌干细胞PI3K/AKT/mTOR通路及相关自噬蛋白影响的机制。方法:免疫磁珠法分选出CD133^(+)HepG2细胞,用体积分数为2%,4%,8%,16%敷和备化方含药血清作用CD133^(+)HepG2细胞,CCK-8法检测细胞增殖活力,选出最佳干预体积分数的敷和备化方含药血清。将CD133^(+)HepG2细胞分为血清对照组、空白对照组、雷帕霉素组和敷和备化方组,分别用含体积分数16%空白大鼠血清的DMEM/F12培养基、无血清DMEM/F12培养基、含0.05%雷帕霉素的DMEM/F12培养基、含体积分数16%敷和备化方含药血清的DMEM/F12培养基培养。流式细胞术检测各组CD133^(+)HepG2肝癌干细胞百分比;RT-PCR法检测各组细胞中PI3K、AKT、mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA表达水平;Western blot法检测各组细胞中PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平;免疫荧光法检测各组细胞中LC3、LC3-Ⅱ的表达水平。结果与结论:①敷和备化方含药血清有抑制CD133^(+)HepG2细胞增殖的作用,其中体积分数为16%敷和备化方含药血清干预72 h抑制作用最明显(P<0.05);②与血清对照组、空白对照组相比,敷和备化方组和雷帕霉素组CD133^(+)HepG2细胞百分比下降(P<0.05),PI3K、AKT、p-mTOR、mTOR、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平均明显下调(P<0.05);PI3K、AKT、mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA表达水平均明显下调(P<0.05);LC3、LC3-Ⅱ的荧光信号强度均明显下调(P<0.05);③与雷帕霉素组相比,敷和备化方组CD133^(+)HepG2细胞中的PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、LC3-Ⅱ蛋白表达水平均明显下调(P<0.05),PI3K、AKT、mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA表达水平均明显下调(P<0.05),LC3、LC3-Ⅱ的荧光信号强度均明显下调(P<0.05);④结果表明,敷和备化方能抑制肝癌干细胞自噬和增殖,其机制与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

细胞因子诱导杀伤细胞分泌因子影响人肝癌干细胞的凋亡

背景:采用自体免疫细胞进行免疫治疗已发展为治疗恶性肿瘤的主要辅助手段之一,但其作用机制尚未阐明。目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞分泌因子对人肝癌干细胞凋亡的影响。方法:采用无血清悬浮细胞培养法富集获得人肝癌干细胞;以γ-干扰素、CD3单克隆抗体和重组人白细胞介素2诱导肝癌患者外周血单个核细胞产生细胞因子诱导的杀伤细胞。将第1代肝癌干细胞分为2组,对照组单纯进行肝癌干细胞培养,实验组将细胞因子诱导的杀伤细胞与肝癌干细胞共培养,培养48 h后用流式细胞仪检测肝癌干细胞的凋亡情况,RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因caspase-3 mR NA与蛋白的表达。结果与结论:(1)对照组的肝癌干细胞凋亡率显著低于细胞因子诱导的杀伤细胞组(P<0.05)。(2)实验组的促凋亡相关基因caspase-3 mR NA和蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)。(3)实验结果表明,细胞因子诱导的杀伤细胞会明显促进肝癌干细胞的凋亡,并显著上调肝癌干细胞促凋亡相关基因caspase-3mR NA和蛋白的表达水平。

经门静脉外周血干细胞移植失代偿期肝硬化患者甲胎蛋白及甲胎蛋白异质体3的监测(英文)

背景:自体干细胞移植治疗肝硬化在临床上已有诸多报道,但迄今为止,关于干细胞与移植后肝硬化的预后转归,干细胞在受损肝内定向分化及恶性学表型等一直是临床专家关注的热点。目的:动态监测经门静脉外周血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化患者的血清甲胎蛋白及甲胎蛋白异质体3变化,评估治疗方法的安全性。方法:纳入2007-04来解放军总参谋部总医院行经门静脉外周血干细胞移植治疗的失代偿期肝硬化患者44例,以化学发光法检测患者术前及术后血清甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体3水平的变化,以甲胎蛋白异质体3(%)≥10%作为阳性判断标准,分析干细胞移植治疗失代偿期肝硬化与肝癌恶性表型的关系。结果与结论:干细胞移植2个月,患者血清甲胎蛋白出现一过性升高,移植前、后患者血清甲胎蛋白异质体3(%)水平差异无显著性意义(P>0.05),且不同甲胎蛋白浓度患者的甲胎蛋白异质体3阳性率及甲胎蛋白异质体3(%)差异无显著性意义(P>0.05)。说明失代偿期肝硬化患者经外周血干细胞移植后临床症状及肝功能得到一定程度恢复。检测肝癌血清学标记物甲胎蛋白异质体3未提示在短期内有恶性生物学表型行为出现。

高低转移潜能肝癌在骨髓间充质干细胞干预前后的Gd-RGD成像

背景:随着现代分子影像学的进步,使骨髓间充质干细胞干预肿瘤效能的实时监测成为可能。目的:构建新型转移相关MRI分子影像探针Gd-RGD,通过MRI成像在体观察骨髓间充质干细胞干预前后肝癌转移和增殖行为的变化。方法:构建MR转移相关因子分子影像探针整合素α_vβ_3配体cRGD-PEG-DGL-DTPA-Gd(Gd-RGD),并进行~1H-MRS及ICP-AES分析鉴定。制作高转移潜能MHCC97-H和低转移潜能MHCC97-L肝癌动物模型,尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液干预6周,计算肿瘤质量抑制率。骨髓间充质干细胞干预后分别用Gd-DTPA和Gd-RGD两种示踪剂进行MRI成像实验,以SNR和CNR为半定量指标。将MHCC97-H和MHCC97-L与骨髓间充质干细胞进行Transwell共培养,置于37℃,体积分数为5%CO_2培养箱内培养48 h后采用qPCR法检测转化生长因子β1、骨桥蛋白、整合素亚单位α_v和β_3的表达。结果与结论:(1)经骨髓间充质干细胞干预后,肝癌肿瘤组织质量明显降低。在第3周时,肿瘤质量抑制率最高;(2)对于高转移潜能肝癌(MHCC97-H),骨髓间充质干细胞干预后Gd-RGD成像SNR和CNR低于骨髓间充质干细胞干预前(P<0.05)。对于低转移潜能肝癌(MHCC97-L),骨髓间充质干细胞干预前后Gd-RGD成像SNR比较差异无显著性意义(P>0.05),骨髓间充质干细胞干预后CNR低于骨髓间充质干细胞干预前(P<0.05);(3)骨髓间充质干细胞干预后Gd-RGD成像SNR在高、低转移潜能肝癌之间差异有显著性意义(P<0.05);Gd-DTPA成像SNR和CNR差异不如Gd-RGD成像差异显著;(4)高转移潜能细胞(MHCC97-H)与骨髓间充质干细胞共培养后,骨桥蛋白、整合素亚单位β_3、转化生长因子β1表达有明显的下降(P<0.05),而α_v表达无明显变化(P>0.05)。低转移潜能细胞(MHCC97-L)与骨髓间充质干细胞共培养后,骨桥蛋白、β_3、转化生长因子β1、α_v表达均下降(P<0.05);(5)结果表明,MRI成像中Gd-DTPA和Gd-RGD示踪剂CNR指标可以很好地区分两种具有高低转移潜能肝癌组织,在骨髓间充质干细胞干预后MRI成像中Gd-DTPA和Gd-RGD示踪剂SNR、CNR指标均可以很好地区分两种具有高低转移潜能肝癌组织,且Gd-RGD效果更优。

人肝癌细胞系MHCC-97H干细胞体外培养及其生物学行为观察

目的培养人肝癌细胞系MHCC-97H中具有干细胞特性的细胞群,探讨其分子生物学特点。方法将人肝癌细胞系MHCC-97H分别培养于干细胞培养体系及普通培养体系(分别为观察组及对照组)。培养10 d后显微镜(100倍及400倍)观察细胞生长情况;免疫荧光法检测细胞表面蛋白CD133、细胞核相关抗原(Ki67)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、多药耐药蛋白1(MDR1)表达;West-blot法检测相应蛋白表达。结果观察组细胞呈半贴壁悬浮生长的克隆球;对照组细胞呈贴壁生长。观察组CD133、MDR1、MMP9呈高表达,对照组未见表达,P<0.05;两组Ki67均呈高表达。结论 MHCC-97H中存在一定数量的肿瘤干细胞,该群细胞是介导肝癌发生转移和耐药的主要因素。

高、低侵袭性肝癌干细胞模型的建立及生物学特性鉴定

目的:采用人肝癌细胞HCCLM3建立高、低侵袭性肝癌干细胞(H/L-ILCSCs)模型,并与HCCLM3和正常肝细胞HL-7702相比较鉴定其生物学特性。方法:(1)利用Transwell小室迁移实验分离获得高、低迁移性HCCLM3细胞,再采用Transwell小室侵袭实验进一步分离获得高、低侵袭性HCCLM3细胞。(2)采用免疫磁珠分选法以CD133^+为分子标志分离高、低侵袭性HCCLM3细胞,获得H/L-ILCSCs。(3)检测H/L-ILCSCs、HCCLM3细胞和正常肝细胞HL-7702干细胞表面标志分子CD133^+、CD90^+、CD44^+的表达。(4)采用CCK-8法、Transwell侵袭、平板克隆形成及免疫缺陷动物成瘤实验,检测H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3及HL-7702的生长增殖、体外侵袭、干细胞球形成及体内裸鼠成瘤能力。结果:表面标志分子CD133^+、CD90^+、CD44^+在H-ILCSCs中高表达,而L-ILCSCs中CD133^+高表达,CD90^+和CD44^+低表达。L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞的生长增殖、体外侵袭、平板克隆形成及体内成瘤能力均低于H-ILCSCs。L-ILCSCs细胞的生长增殖和体外侵袭能力均低于HCCLM3细胞。此外,L-ILCSCs不能形成克隆球和移植瘤。结论:从正常人肝癌细胞HCCLM3中可以分离和富集H/L-ILCSCs,且二者生物学特性存在差别。

KLF4对肿瘤干细胞自我更新和增殖潜能的影响

目的:分析Kr櫣ppel样因子4(Krppel-like factor4,KLF4)对肿瘤干细胞T3A-A3自我更新和增殖能力的影响。方法:构建靶向干扰KLF4的慢病毒载体pLVTHM-shKLF4,利用前期实验分离与鉴定的肿瘤干细胞T3A-A3,应用RT-PCR和Western blotting分别检测pLVTHM-shKLF4感染后T3A-A3细胞中KLF4mRNA和蛋白的表达。细胞球形成实验检测pLVTHM-shKLF4感染对T3A-A3细胞自我更新的影响,平板集落形成实验检测T3A-A3细胞的克隆形成能力,流式细胞术检测T3A-A3细胞周期变化。裸鼠皮下移植瘤实验观察pLVTHM-shKLF4干扰KLF4表达后对T3A-A3细胞移植瘤生长的影响。结果:与肝癌细胞BEL-7402、HepG2相比,肿瘤干细胞T3A-A3表达更高水平的KLF4;pLVTHM-shKLF4感染能够在mRNA和蛋白水平下调T3A-A3细胞中KLF4的表达。pLVTHM-shKLF4感染的T3A-A3细胞形成细胞球的直径明显小于对照病毒的pLVTHM-shNC感染的T3A-A3细胞[(104.33±16.28)vs(186.67±28.15)μm,P<0.01],pLVTHM-shKLF4感染细胞形成的细胞克隆数目明显少于对照细胞[(83.5±7.78)vs(125±9.19)个,P<0.01),pLVTHM-shKLF4感染的T3A-A3细胞G1期比例明显升高[(39.65±4.03)%vs(29.35±1.00)%,P<0.01]。pLVTHM-shKLF4感染的T3A-A3细胞的移植瘤生长速度较对照细胞移植瘤明显减慢[细胞接种33 d,(46.14±12.94)vs(228.12±94.86)mm3,P<0.01]。结论:干扰KLF4的表达可抑制肿瘤干细胞T3A-A3的自我更新及其在体内外的增殖潜能。

白血病干细胞抗原在急性髓系白血病中的表达及临床意义

目的:分析白血病干细胞(LSC)相关抗原在急性髓系白血病(AML)中的特点,探讨LSC特异性抗原与AML的类型、细胞遗传学及临床疗效的关系。方法:选取2013年1月-2016年3月在本院血液科住院的初诊急性髓系白血病(除外M3)患者61例,采用直接免疫荧光FCM进行白血病细胞的免疫表型及Tim-3、CD96、CD123检测,患者分为阳性组与表达阴性组,分析LSC抗原表达水平及与高白细胞计数、染色体、疗效的关系。结果:61例初诊AML(除外M3)患者中,Tim-3、CD96、CD123表达率分别为52.45%、44.26%、55.73%;在各亚型中的表达率与总体病例表达阳性率比较差异无统计学意义(P> 0.05)。Tim-3、CD96、CD123表达阳性的患者更容易出现高白细胞计数,但与表达阴性的患者比较差异无统计学意义(P> 0.05);Tim-3、CD96表达阳性的患者中检测出预后不良染色体核型比例较高,与表达阴性的患者比较差异有统计学意义(P <0.05); CD123表达阳性与阴性的患者中检测出预后不良染色体核型比例相差不大(P> 0.05)。2个化疗疗程后Tim-3、CD96、CD123表达阳性的患者完全缓解率明显低于表达阴性的患者(P <0.05)。Tim-3、CD96表达阳性与阴性患者的总生存(OS)期比较,差异有统计学意义(P <0.05),CD123表达阳性与阴性患者OS期相差不大。结论:Tim-3、CD96、CD123在初诊AML(除外M3)各亚型中的表达水平与总体病例表达水平相差不大;Tim-3、CD96、CD123表达阳性的患者容易出现高白细胞计数,且2个化疗疗程后完全缓解率明显低于表达阴性的患者;Tim-3、CD96表达阳性患者中检测出预后不良染色体核型比例高,同时其总生存期也短于阴性患者。

肝细胞癌患者外周血T细胞Tim-3的表达及氩氦刀治疗对Tim-3表达的影响

目的:探讨肝细胞癌(HCC)患者外周血T细胞表面T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(Tim-3)的表达,以及氩氦刀治疗对Tim-3表达的影响。方法:收集2019年7月至2021年1月于郑州大学第五附属医院进行治疗的50例HCC患者的外周静脉血标本,其中38例患者进行了肝脏肿块氩氦刀治疗,治疗后再次收集外周静脉血标本,同时采集26例健康志愿者外周静脉血标本。采用流式细胞术检测HCC患者及健康志愿者外周血T细胞Tim-3的表达,检测HCC患者外周血Tim-3阳性及Tim-3阴性T细胞早期凋亡分子[膜联蛋白(Annexin-V)抗体]和内因子[干扰素-γ(IFN-γ)]的表达水平,比较38例HCC患者行氩氦刀治疗前后外周血T细胞Tim-3的表达水平。结果:HCC患者外周血T细胞Tim-3的表达高于健康志愿者[(14.351±3.282)%比(5.564±1.750)%,P<0.01]。HCC患者Tim-3阳性T细胞分泌IFN-γ水平低于Tim-3阴性T细胞[(17.647±3.435)%比(25.439±4.151)%,P<0.01]。HCC患者Tim-3阳性T细胞Annexin V表达水平高于Tim-3阴性T细胞[(18.180±3.102)%比(9.479±2.371)%,P<0.01]。38例HCC患者经氩氦刀治疗前的外周血T细胞Tim-3的表达水平与治疗后比较差异未见统计学意义[(14.251±3.383)%比(13.556±2.795)%,P>0.05]。结论:HCC患者外周血T细胞Tim-3表达增高,导致T细胞功能耗竭,Tim-3可作为HCC的有效治疗靶点,氩氦刀治疗对HCC患者Tim-3表达无明显影响。

Tim-3 mRNA在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病中的作用

目的探讨T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域分子3（Tim-3）mRNA表达在异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）后急性移植物抗宿主病（aGVHD）中的作用。方法回顾性分析100例allo—HSCT患者，根据患者aGVHD状态[0（未发生）～I度aGVHD组、Ⅱ。Ⅳ度aGVHD治疗前组、Ⅱ～Ⅳ度aGVHD治疗好转组]及移植后不同阶段（＋14＋30d、＋31-＋60d、＋61～＋100d）比较各组外周血单个核细胞Tim-3mRNA及血浆IFN-У、IL-2水平。结果0～I度aGVHD患者＋31-＋60dTim-3mRNA相对定量（7．24±2．79）明显高于＋14～＋30d（4．60＋1．66）及＋61～＋100d（3．86±1．36）（P值均〈0．05）；＋14～＋30d、＋31-＋60d、＋61-＋100dII～IV度aGVHD治疗前组的Tim-3mRNA水平分别为9．54±3．05、10．14±3．28、12．82±4．20＋1±30d、＋61±100d，均高于0～I度aGVHD组及治疗好转组；＋31-＋60dⅡ-IV度aGVHD治疗前组明显高于治疗好转组（2．49±0．89），与0～I度aGVHD组（7．24±2．79）相比差异无统计学意义；11～Ⅳ度aGVHD组中Tim一3mRNA水平在不同aGVHD程度、不同脏器之间比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。Ⅱ-Ⅳ度aGVHD治疗前组血浆IFN-1、IL-2水平明显高于其他各组，治疗好转组血浆IFN小IL一2水平与0～I度aGVHD组比较差异无统计学意义。结论Tim-3在aGVHD的发生过程中发挥着重要作用。

多药耐药肝癌细胞通过激活Smad3活性富集CD133＋亚群细胞

肿瘤干细胞是肿瘤化疗失败的根源。在乳腺癌、肺癌及结直肠癌中，研究表明化疗可以富集肿瘤干细胞。然而化疗富集肿瘤干细胞的机制并不明确。CD133分子作为分离肿瘤干细胞的常用标记，已在大量实体瘤中被证明。CD133肝癌细胞已被证实具有肝癌干细胞的生物学特性旧引。化疗能否富集肝癌干细胞，目前研究报道较少。本研究旨在观察化疗能否有效地富集肝癌干细胞（CD133肝癌细胞）并分析其调节肝癌干细胞的分子机制。

PI3K/Akt信号通路对肝癌细胞系HepG2中SP细胞的影响

[目的]探讨PI3K/Akt信号通路对肝癌细胞系HepG2中肿瘤干细胞比例及干细胞特性的影响。[方法]使用PI3K/Akt通路抑制剂处理HepG2细胞后,使用流式技术分析HepG2细胞系中的侧群(SP)细胞的变化。软琼脂克隆形成实验检测PI3K/Akt抑制剂对HepG2细胞中SP细胞和非SP细胞成克隆能力的影响。[结果]HepG2细胞中存在SP细胞,经过LY294002处理后,SP细胞比例下降。LY294002可以显著降低SP细胞的软琼脂成克隆能力,对非SP细胞的软琼脂成克隆能力影响不明显。[结论]HepG2细胞中的SP细胞具有干细胞特性,PI3K/Akt信号通路对HepG2细胞中SP细胞的维持起重要作用,抑制PI3K/Akt信号通路后HepG2细胞中的SP细胞比例明显减低,并能显著抑制SP细胞的增殖速度、软琼脂成克隆能力,增加SP细胞对化疗药物的敏感性,为更加深入地了解肝癌干细胞的特性以及探索针对肿瘤干细胞的治疗提供理论依据。

硫利达嗪对肝癌干细胞的杀伤作用研究

硫利达嗪(Thioridazine,THO)在临床上通常用于治疗精神类疾病;近年来,研究发现THO对肿瘤细胞具有杀伤效果,但其对肝癌干细胞的杀伤作用还未曾有报道。肿瘤干细胞在肿瘤的转移、复发及耐药性方面起着十分重要的作用。利用体外悬浮培养富集肿瘤干细胞并检测药物THO对其杀伤效果,并以此评价THO对肿瘤生长的体外抑制效应。通过检测体外悬浮培养肝癌干细胞在肿瘤干细胞相关因子表达、耐药性及细胞周期等方面因素,显示在一定程度上其具备肿瘤干细胞样特征,磷酸化STAT3、NANOG和XIAP表达显著上调,而Albumin表达下调;进一步运用MTT、Western blotting和细胞流式等实验验证了THO对肝癌干细胞具有较强的杀伤效果并能诱导caspase依赖的细胞凋亡,而对分化的肝癌细胞影响较弱;此外,THO和化疗药物盐酸阿霉素(DOX)的联合使用显著增强了其对肝癌干细胞和分化的肝癌细胞的杀伤作用。因此,该结果首次显示THO对肝癌干细胞具有较强的杀伤能力,可能为今后肝癌的临床治疗带来新的希望。