生物钟蛋白TIMELESS对乳腺癌细胞增殖和侵袭转移的差异调控

生物钟蛋白TIMELESS是生物体周期节律相关的核心分子钟的一员。TIMELESS可以调节细胞的增殖和代谢,DNA损伤的识别和修复等。研究发现,TIMELESS的表达与肝癌、肺癌、结直肠癌和鼻咽癌等的发生发展明显关联。在乳腺癌中,TIMELESS的调节作用和机制仍不十分清晰。本文分别研究了TIMELESS在乳腺癌细胞增殖和转移方面的调控作用。通过细胞增殖实验发现,TIMELESS可明显促进乳腺癌细胞的增殖。克隆形成实验发现,在乳腺癌细胞ZR-75-30和T-47D中,TIMELESS过表达分别上调克隆数量约1.6倍和1.8倍。通过报告基因检测对雌激素信号通路的研究发现,TIMELESS和雌激素受体ERα(estrogen receptor)共表达与单转ERα相比,使得雌激素受体ERα的转录活性提高约3倍;而通过对于Basal型乳腺癌患者生存曲线分析发现,Timeless高表达与basal型乳腺癌患者的生存率正相关。基于此,我们进一步研究了TIMELESS对于乳腺癌细胞转移的调控作用。通过细胞划痕实验和F-肌动蛋白组装检测发现,TIMELESS抑制乳腺癌细胞的转移;同时,TIMELESS敲低提高了乳腺癌细胞的转移数量约1.6倍,并下调了上皮标志物E-钙黏着蛋白的表达,上调了间质标志物N-钙黏着蛋白表达。本研究提示,TIMELESS在调控乳腺癌的增殖和转移过程中存在差异调控,即TIMELESS促进乳腺癌细胞增殖,而抑制了乳腺癌细胞的转移。这为生物钟蛋白质调控乳腺癌的发生发展提供了分子基础,同时为乳腺癌的分型治疗提供了一定的理论依据。

生物钟基因Timeless在HBV相关肝癌组织中的表达及其与乙肝病毒X蛋白的关系

目的探讨生物钟基因Timeless在HBV相关肝癌中的表达及其与乙肝病毒X蛋白(HBx)的关系。方法选择60例HBV相关肝癌患者,取其癌组织及癌旁正常组织,采用免疫组化法观察Timeless的表达,分析Timeless表达与患者临床病理参数的关系。取人正常肝细胞系LO2、肝癌细胞系Hep G2,分别转染pc DNA3.1-HBx质粒和pc DNA3.1质粒,采用Real-time PCR和Western blotting法检测细胞内Timeless mRNA及其蛋白表达。结果肝癌组织及癌旁正常组织Timeless阳性表达率分别为60.0%(36/60)、38.3%(23/60),二者比较P<0.05。Timeless阳性表达与肝癌患者血管侵犯有关(P<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤组织分化程度、血清AFP水平无关(P均>0.05)。转染pc DNA3.1-HBx质粒的Hep G2细胞和LO2细胞Timeless mRNA及其蛋白相对表达量均明显高于转染pc DNA3.1质粒细胞(P均<0.05)。结论 HBV相关肝癌组织中Timeless高表达,其表达变化与HBV相关肝癌的发生、发展有关;HBx可能是引起Timeless表达升高的原因之一。

沉默生物钟基因Timeless对卵巢癌SKOV3细胞凋亡和侵袭能力的影响

目的:探讨沉默生物钟基因Timeless(TIM)对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡和侵袭能力的影响。方法:免疫组化法检测卵巢癌组织及正常卵巢组织中TIM蛋白表达,分析TIM表达与卵巢癌病理特征的相关性。选取卵巢癌SKOV3细胞,随机分为空白对照组、siRNA对照组和TIM沉默(TIM siRNA)组。采用Western blot检测TIM、Bcl-2、Bax、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、caspase-3和caspase-9蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果:TIM蛋白在正常卵巢组织中呈阴性表达,在卵巢癌组织中呈阳性表达。卵巢癌组织中TIM阳性表达率(84.0%)显著高于正常卵巢组织(10.0%;P<0.01)。TIM表达与卵巢癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05),而与年龄和病理类型无关(P>0.05)。TIM siRNA组中TIM、MMP-2、MMP-9和Bcl-2的蛋白表达显著低于空白对照组和siRNA对照组(P<0.01),而Bax、caspase-3和caspase-9的蛋白表达显著高于空白对照组和siRNA对照组(P<0.01);空白对照组和siRNA对照组之间TIM、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9蛋白表达的差异无统计学显著性(P>0.05)。TIMsiRNA组的细胞凋亡率显著高于空白对照组和siRNA对照组(P<0.01);空白对照组和siRNA对照组之间细胞凋亡率的比较差异无统计学显著性(P>0.05)。TIM siRNA组的细胞穿膜数显著低于空白对照组和siRNA对照组(P<0.01);空白对照组和siRNA对照组之间细胞穿膜数的差异无统计学显著性(P>0.05)。结论:利用siRNA沉默卵巢癌SKOV3细胞中TIM表达,可促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭。

TIPIN分子通过调控糖代谢促进肝癌细胞生长

目的:永恒昼夜节律相互作用蛋白(timeless circadian clock interacting protein,TIPIN)在肝癌中高表达且与肝癌的恶性进展有关,但TIPIN在肝癌中的生物学作用尚不清楚。本研究探讨TIPIN对肝癌细胞糖代谢的影响及其分子机制。方法:在基因表达谱数据交互分析(the Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)数据库中分析TIPIN在肝癌组织中的表达及其与患者预后的关系。实时定量PCR和蛋白质印迹实验检测肝癌细胞和正常肝细胞中TIPIN的表达,在高表达TIPIN的MHCC97H和低表达TIPIN的MHCC97L中,分别敲减TIPIN和过表达TIPIN,检测细胞葡萄糖摄取、乳酸生成、pH、细胞生长、氧耗量和糖代谢关键调控分子的表达。结果:TIPIN在肝癌组织中的表达高于正常肝组织(P<0.05),且高表达TIPIN的患者总生存期及无病生存期较低表达TIPIN的患者短(均P<0.05)。与正常肝细胞HL7702相比,肝癌细胞MHCC97L、HepG2、HuH7、MHCC97H中TIPIN的表达水平均明显升高(均P<0.01)。TIPIN敲减后细胞葡萄糖摄取和乳酸生成水平降低,而细胞耗氧量和培养基p H增加(均P<0.05);TIPIN过表达后细胞葡萄糖摄取和乳酸生成水平升高,而细胞耗氧量和培养基pH降低(均P<0.05)。TIPIN敲减后p53表达上调(P<0.01),过表达TIPIN后p53表达减少(P<0.01),而缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和髓细胞增生原癌基因(myelocytomatosis oncogene,c-MYC)均未见改变。在MHCC97H细胞中干扰p53后可以恢复只敲减TIPIN造成的生长抑制(P<0.01),且糖代谢表型与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);在MHCC97L细胞中过表达TIPIN后细胞生长能力增强(P<0.01),但过表达TIPIN和p53会抑制细胞生长(P<0.01),且糖代谢表型与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);结论:TIPIN通过抑制p53的表达来增强细胞糖酵解和抑制氧化磷酸化,进而促进肝癌细胞生长。