胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合三维支架体外构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨以胶原(collagen,Col)-透明质酸(hyaluronicacid,HA)-硫酸软骨素(chondroitinsulfate,CS)为支架材料构建组织工程软骨的可行性。方法以乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐为交联剂通过冷冻干燥的方法制备Col-HA-CS复合支架及单纯Col支架。通过扫描电镜、HE染色对Col-HA-CS复合支架材料形态进行观察。分离培养幼兔关节软骨细胞,将体外扩增的软骨细胞接种在两种支架上,通过组织学、扫描电镜观察软骨细胞在支架上的生长形态;通过生物化学功能检测细胞-支架复合物中DNA、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;RT-PCR方法检测在Col-HA-CS复合支架上的软骨细胞Col的表达情况。结果软骨细胞在Col-HA-CS复合支架材料上增殖分化良好,并保持软骨细胞特异的分化Col表型,培养21d后已有软骨样组织形成,出现软骨陷窝。DNA和GAG含量测定显示软骨细胞在复合支架上随时间增加逐渐扩增并分泌大量的GAG,含量明显高于单纯Col支架材料,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Col-HA-CS复合支架材料可为软骨细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境,在软骨组织工程的支架材料领域有较广泛的应用前景。

胶原-透明质酸支架的制备及其与软骨细胞复合培养的实验研究

目的制备胶原-透明质酸支架,评价其与兔髁状突软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。方法冷冻干燥法制备胶原-透明质酸复合多孔海绵支架材料,将其与碳化二亚胺[1-ethyl-3-（3-dimethyl aminopropyl）carbodiimide,EDC]进行化学交联。分别采用体积法和体外酶解实验测定支架材料孔隙率和降解率,扫描电镜观察交联前后支架材料的形态变化。取3周龄新西兰兔髁状突软骨细胞,体外培养5d后,甲苯胺蓝染色,倒置相差显微镜下观察行细胞鉴定。取消化后第2代软骨细胞接种至支架材料复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。复合培养1、3、5、7和10d后,PBS液清洗3次,置入24孔板并以0.25%胰酶和0.1%EDTA消化细胞,采集细胞进行细胞计数并绘制细胞生长曲线。另取部分样本继续培养5d,行组织学和扫描电镜观察。结果胶原-透明质酸支架材料经化学交联后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为83.7%,孔径100-120μm;交联后抗酶解能力显著增加。髁状突软骨细胞在其表面和内部贴附良好,形成细胞-材料复合体,细胞增殖实验显示,复合培养1d,材料中细胞数为3.7×104/支架,10d后增至8.2×104/支架。电镜观察见细胞周围有基质分泌。结论EDC交联后的胶原-透明质酸支架具有良好空间结构和生物相容性,可作为支架材料用于髁状突软骨组织工程的研究。

利用胶原和聚乙烯醇构建组织工程软骨支架

目的依据仿生学原理,应用Ⅱ型胶原蛋白(type-Ⅱcollagen,CoⅡ)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)、透明质酸(hyaluronan,HA)和聚乙烯酸(polyvinyl alcohol,PA)来制备组织工程支架材料。方法依据人体正常关节软骨细胞外基质主要成分Ⅱ型胶原、硫酸软骨素和透明质酸;添加高分子聚合物PVA来提高支架强度,应用冷冻干燥等技术制备复合支架,接种细胞体外静态培养7d,通过力学测试、扫描电镜和组织染色等方法对支架进行检测。结果支架孔隙均匀,孔隙率为93%～95%,CoⅡ-CS-HA-PVA复合支架最大张力约为1.19N,单纯CoⅡ-CS-HA复合支架约为0.55N,差异有统计学意义(t=4.985,P=0.002),细胞在支架上均匀分布,活力旺盛。结论 CoⅡ-CS-HA-PVA复合支架具备良好的生物相容性,可为种子细胞增殖分化提供一个适宜的环境,有很好的临床应用前景。

仿生髓核组织工程细胞支架的构建及初步理化指标分析

目的设计构建一种新型仿生髓核组织工程的细胞支架,以用于髓核组织工程的实验研究.方法以猪Ⅱ型胶原和透明质酸在pH 1～2的环境下混合,先行制备Ⅱ型胶原/透明质酸海绵,再以水溶性碳化二亚胺交联并复合6-硫酸软骨素,从而获得与生理条件下髓核细胞外基质主要成份相同的仿生髓核组织工程细胞支架.并对其理化指标进行初步分析.结果所制备的支架材料为多孔结构,其孔径为89～132μm,孔隙率为94.8%.含水能力为79.2%,热变性温度为74.6℃,糖胺多糖含量为224.6 mg/g,弹性模量为0.673 MPa.结论我们对所制备支架材料的理化指标初步分析认为:该支架符合理想支架材料的结构要求.可对该支架的性能进行深入的研究.

等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料的制备及性能评价

背景:聚氨酯具有优异的机械性能和良好的生物相容性,但其疏水性不利于细胞黏附生长,故限制了聚氨酯在皮肤支架上的应用。目的:对聚氨酯支架材料进行改性,观察其形态结构,检测其亲水性、机械性能及细胞毒性。方法:通过静电纺丝方法制备聚氨酯支架材料,然后进行CO2、NH3等离子体处理,最后通过交联剂交联,与胶原蛋白及硫酸软骨素复合,制备等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料,设置为A组;设置3组对照,聚氨酯经静电纺丝后进行等离子体处理制备成支架材料后,浸泡在未加交联剂的胶原硫酸软骨素混合溶液中,取出风干,设为B组;聚氨酯经静电纺丝后进行等离子体处理,制备成支架材料,设为C组;将聚氨酯进行静电纺丝,制备成支架材料,设为D组。对比4组材料的形态结构、亲水性、机械性能及体外细胞毒性。结果与结论:等离子体处理聚氨酯-胶原-硫酸软骨素复合材料具有良好的纤维形貌、亲水性及机械性能,可促进细胞的黏附、增殖,无细胞毒性。

静电纺丝构建胶原-透明质酸钠-硫酸软骨素组织工程关节软骨支架的工艺探索

目的探索以胶原、透明质酸钠和硫酸软骨素三种细胞外基质为原料,利用静电纺丝技术构建组织工程关节软骨支架的工艺。方法固定静电纺丝的参数,通过改变溶剂的种类,浓度和三种原料之间的比例,探索胶原-透明质酸钠-硫酸软骨素复合支架的纺丝条件。结果胶原-透明质酸钠-硫酸软骨素复合支架纺丝的最佳溶剂是3-氟乙醇和水的混合溶剂(v:v,1:1),最佳纺丝浓度范围为80~120mg/m L,三种原料支架的最佳比例范围为6~8:1:1~2。支架纤维的直径和孔隙率则由原料的浓度和比例共同决定;支架降解性能良好,降解速度主要由胶原含量决定。结论研究者成功的利用静电纺丝技术构建了胶原-透明质酸钠-硫酸软骨素复合组织工程软骨支架。这种支架在成分和形态上都可以较好的模拟关节软骨细胞外环境,是一种具有良好应用前景的组织工程关节软骨支架。

Ⅱ型胶原注射骨关节炎时C-反应蛋白及类风湿因子的表达

背景:Ⅱ型胶原和硫酸软骨素是关节软骨的重要组成成分,不仅具有保护软骨的作用,还能抑制关节炎的病变。目的:通过检测类风湿因子和C-反应蛋白的表达评价Ⅱ型胶原及Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素注射对骨性关节炎的疗效。方法:采用改良Hulth法制作大鼠膝关节骨性关节炎模型,造模后模型组关节腔注射生理盐水、透明质酸钠组给予透明质酸钠凝胶注射、Ⅱ型胶原组给予单纯Ⅱ型胶原注射、Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素组给予Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素注射治疗。各组动物于术后进行日常观察、称质量、血清抗体及组织病理检查。结果与结论:造模后模型组大鼠血类风湿因子和C-反应蛋白水平均有所升高,炎症加剧;而与模型组相比,各给药组大鼠类风湿因子和C-反应蛋白水平均有所下降,炎症有所减轻,其中Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素组大鼠血清中类风湿因子水平显著下降(P<0.01)。结果显示Ⅱ型胶原与透明质酸钠均具有预防和治疗骨关节炎的作用,能缓解骨关节炎病变,Ⅱ型胶原联合硫酸软骨素的疗效更明显。

基于细胞外基质特性构建三维软骨纳米支架材料及表征

目的基于细胞外基质特性,制备三维软骨纳米支架材料。方法将水、三氟乙醇、六氟异丙醇混合作为溶剂,对Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)、玻璃酸(HA)、硫酸软骨素(CS)静电纺丝。测定支架材料的结构、形貌、热学性能、力学性能和疏水性。结果 Col-Ⅱ、HA、CS间存在相互作用,支架材料具有疏水性且保留Col-Ⅱ部分三螺旋结构。在研究范围内,支架纤维光滑细长,纤维直径分布集中。支架材料热稳定性良好,拉伸性能在质量比7∶1∶1时达到最优。结论制备的三维软骨纳米支架材料具有良好的热学、力学和结构特性,有望应用于软骨修复。

胶原-透明质酸-硫酸软骨素构建组织工程软骨纳米支架的实验研究

目的探讨胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合构建软骨组织工程三维纳米支架的可行性。方法2012年12月至2014年6月,在川北医学院组织工程与干细胞研究所将胶原-透明质酸-硫酸软骨素溶于三氟乙醇和水混合溶剂中制成静电纺丝溶液,制备组织工程软骨纳米支架材料。扫描电镜观察其表面形貌,测定其纳米纤维直径、吸水率、表面接触角和降解率及生物学特性。兔软骨细胞种植于支架上,用细胞计数试剂盒评估细胞存活情况。结果在静电纺丝浓度范围80~120 mg/ml,胶原-透明质酸-硫酸软骨素比例6.0∶0.5∶1.0条件下,可成功制备出组织工程软骨纳米支架,当电纺液浓度为10%时,纳米纤维直径相对均匀,无串珠形成,支架纤维直径(289.5±162.9)~(414.7±71.5)nm。经过理化检测显示:支架具有良好的亲水性,接触角最高达(34±15)°,30 d时降解比较稳定,降解率最高达68%,软骨细胞在支架上24 h存活率最高达70%。结论以胶原-透明质酸-硫酸软骨素制备的组织工程软骨纳米支架材料有良好的物理和生物学性能,在组织工程软骨构建中有一定应用前景。