组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的探索由人表皮干细胞、成纤维细胞与纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性。方法将人全层皮肤采用胰蛋白酶消化法使表皮干细胞和真皮成纤维细胞分离后,分别在无血清培养基中行原代及传代培养。将体外扩增培养至第3、4代的表皮干细胞(5×104/mL)和真皮成纤维细胞(1×104/mL)共0.5mL与纤维蛋白支架(0.5mL)混合凝固构建组织工程皮肤。取4～5周龄雄性裸鼠45只,体重19.5～20.3g,平均20.0g,制备背部全层皮肤缺损模型。随机分为5组,每组9只,分别为空白对照组(C组),创面仅覆盖凡士林油纱,自然愈合;单纯支架组(F组),创面移植无细胞的纤维蛋白支架;表皮支架组(S组),创面移植含有表皮干细胞的纤维蛋白支架复合物;成纤维细胞支架组(Fb组),创面移植含有成纤维细胞的纤维蛋白支架复合物;组织工程皮肤组(T组),创面移植组织工程皮肤。术前及术后1、3、6、8周行全身及移植部位大体观察;移植后3、6、8周,取材行组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察。结果?细胞培养4周后,表皮干细胞培养皿内可见圆形细胞,在加有BrdU的培养液中培养6d后可见BrdU染色阳性细胞;成纤维细胞培养皿内可见梭形细胞。构建的组织工程皮肤可见CK19免疫荧光染色阳性细胞、Nestin染色阳性细胞。移植后T组新生皮肤较其余各组生长快、瘢痕轻。术后6周,C、F、S、Fb及T组皮肤厚度分别为:(0.460±0.049)、(0.480±0.055)、(0.540±0.043)、(0.510±0.032)及(0.660±0.047)mm,T组明显厚于其余各组,且差异有统计学意义(P<0.05)。术后3、6、8周,HE染色及扫描电镜示,T组新生表皮层数及真皮成纤维细胞、血管数量均多于其余各组,且T组真皮血管及胶原纤维排列均较其余各组整齐;术后3周,Ⅳ型胶原免疫组织化学染色显示,T组已形成连续的染色带,而其余各组均不连续;术后6周,CK14免疫组织化学染色显示,T组可见阳性细胞,其余各组均未见。结论用表皮干细胞、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植后能使创面迅速愈合,可望成为一种较理想的组织工程皮肤。

脂肪组织来源干细胞复合胶原构建组织工程皮肤修复皮肤缺损

目的:探讨脂肪组织来源干细胞(ADSC)作为皮肤组织工程种子细胞修复皮肤缺损的可能性。方法:采用胶原酶消化SD大鼠脂肪组织,经体外扩增后接种于胶原凝胶构建组织工程活性皮肤替代物。15只SD大鼠随机分成3组:ADSC复合胶原组织工程活性皮肤替代物实验组、单纯胶原移植组和空白对照组。将各组相应材料分别移植于SD大鼠背部皮肤缺损处,比较观察创面修复效果。结果:ADSC复合胶原实验组、单纯胶原移植组和空白对照组创面愈合时间分别为:(14.3±1.7),(16.9±2.5)和(21.2±4.2)d,差异有显著性意义(P<0.05)。组织学观察显示,ADSC复合胶原实验组成纤维细胞、微血管、胶原纤维均较单纯胶原移植组和空白对照组明显增多。结论:ADSC复合胶原构建的组织工程活性皮肤替代物移植后可加速新生血管形成、促进创面修复。提示以ADSCs作为种子细胞复合胶原构建的组织工程皮肤可用于皮肤缺损的修复治疗。

脂肪干细胞和纤维蛋白胶快速构建人工皮肤修复创面的研究

目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠脂肪组织来源干细胞(ADSCs)与纤维蛋白胶复合快速成型构建组织工程皮肤替代物修复皮肤缺损的可行性。方法:采用胶原酶消化GFP小鼠脂肪组织,获得GFP小鼠脂肪干细胞(ADSCs),并证明其具有成骨和成脂的多向分化能力,经体外扩增后复合纤维蛋白胶快速成型构建组织工程活性皮肤替代物。15只C57鼠随机分成3组:ADSCs复合纤维蛋白胶组织工程活性皮肤替代物实验组、单纯纤维蛋白胶移植组和空白对照组。将各组相应材料分别移植于C57BL小鼠背部皮肤缺损处,比较观察创面修复效果。结果:分离的细胞具有不断的增殖能力,并具有多向分化潜能。同种异体移植后,免疫荧光检测创面有大量GFP小鼠脂肪干细胞存活。ADSCs复合纤维蛋白胶可以缩短创面愈合时间。组织学观察显示,ADSCs复合纤维蛋白胶实验组上皮形成较厚,真皮层胶原纤维排列有序,成纤维细胞数量较单纯纤维蛋白胶移植组和空白对照组明显增多。结论:GFP-ADSCs复合纤维蛋白胶构建的组织工程皮肤替代物移植后可加速小鼠皮肤创面愈合,提示以ADSCs作为种子细胞复合纤维蛋白胶快速成型构建的组织工程皮肤可用于皮肤缺损的修复治疗。

骨髓间充质干细胞促进皮肤创伤愈合的研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在组织工程皮肤修复创面缺损中的作用.方法:以标记了PKH26的MSCs为种子细胞构建组织工程皮肤,修复皮肤缺损,HE染色和免疫组织化学染色观察愈合效果,荧光检测追踪细胞转归.结果:移植2wk后实验组创面基本愈合,愈合时间明显快于对照组,6wk时仍可检测到红色荧光标记的骨髓间充质干细胞,免疫组织化学染色显示角蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性.结论:含有MSCs的组织工程皮肤移植后促进创面愈合,骨髓间充质干细胞在皮肤创伤愈合中起了重要作用,可作为组织工程领域中理想的种子细胞.

β射线照射皮肤损伤创面注射骨髓间充质干细胞后的创面愈合

背景:β射线皮肤损伤创面难愈,尚无有效的治疗方法。目的:观察骨髓间充质干细胞对β射线皮肤损伤创面愈合的影响。方法:①选用SD雌性大鼠3只分离培养骨髓间充质干细胞,传代细胞生长至第5代,DAPI标记细胞,制备骨髓间充质干细胞悬液。②选3月龄清洁级SD雌性大鼠47只,随机分为3组:治疗组应用直线加速器产生的β射线(45Gy)单次照射大鼠臀部皮肤40mm×30mm,建立急性深Ⅱ度β射线皮肤损伤动物模型,创面出现后将骨髓间充质干细胞悬液注入大鼠创面皮下及真皮层;对照组β射线照射同治疗组,创面出现后注射安慰剂,用法同治疗组。正常组为正常大鼠。光镜下观察治疗后1,2,3,4周各组大鼠创面组织病理学变化,免疫组织化学方法检测CD31、CK4、成纤维细胞生长因子含量的动态变化。结果与结论:治疗组创面愈合时间比对照组明显加快(P<0.05)。治疗组注射骨髓间充质干细胞细胞悬液后1-4周CD31、CK4、成纤维细胞生长因子阳性细胞值明显高于对照组(P<0.05)。证实骨髓间充质干细胞能促进β射线皮肤损伤创面的愈合,缩短创面愈合的时间。

人脱细胞真皮复合骨髓间充质干细胞构建组织工程皮肤修复皮肤创面缺损

背景:构建组织工程皮肤的种子细胞和支架材料多种多样,探索更为合适的构建方法亦是国内外专家学者争相研究的热点。目的:探讨组织工程皮肤促进大鼠皮肤缺损创面愈合的可行性。方法:选用6-8周龄SD大鼠,采用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞。利用人包皮为材料,采用酶消化法制作脱细胞真皮。以骨髓间充质干细胞为种子细胞,脱细胞真皮为支架材料,构建组织工程皮肤,将其覆盖于SD大鼠皮肤缺损创面,另设置单纯移植脱细胞真皮组和空白对照组。记录创面愈合时间并计算创面闭合指数。移植2周后创面取材行苏木精-伊红染色,CK19及Brd U免疫组织化学染色,以评价创面的愈合情况。结果与结论:(1)3组创面闭合指数:组织工程皮肤组>脱细胞真皮组>空白对照组,组间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05);(2)3组创面愈合时间:组织工程皮肤组<脱细胞真皮组<空白对照组,组间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05);(3)组织工程皮肤组有Brd U阳性细胞表达,组织工程皮肤组CK19表达显著高于脱细胞真皮组、空白对照组;(4)结果表明,应用骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮构建的组织工程皮肤对全层皮肤缺损创面具有很好的促进愈合作用。

人脐带间充质干细胞移植治疗小鼠皮肤溃疡

背景:人脐带间充质干细胞对于皮肤溃疡的治疗需进行更多方面的评估。目的:探讨人脐带间充质干细胞促进小鼠皮肤溃疡愈合的可能性。方法:取C57小鼠20只,随机分成对照组和实验组,每组10只。用无菌剪刀在小鼠背部建立纵行皮肤创面模型,创面约2.5 cm×2.0 cm大小,深度约5 mm。造模后,实验组创周和创面注射1 mL人脐带间充质干细胞悬液,对照组注射等量生理盐水。每天测量两组小鼠溃疡面积,计算创面愈合率,并于移植0,7,14 d取小鼠皮肤溃疡周围组织,免疫组织化学检测血管内皮生长因子的表达,免疫荧光染色检测抗细胞核抗体MAB1281表达用于评估人脐带间充质干细胞在溃疡周围的残留率。结果与结论:(1)实验组溃疡愈合时间短于对照组(P <0.05);(2)实验组创面血管内皮生长因子表达量明显高于对照组(P <0.05);(3)移植后0 d人脐带间充质干细胞残留最多,随着皮肤溃疡的愈合,人脐带间充质干细胞在溃疡周围残留量逐渐减少;(4)结果表明,人脐带间充质干细胞在小鼠体内可能通过旁分泌血管内皮生长因子的方式促进局部血管新生,进而促进皮肤溃疡愈合。

组织工程皮肤的体外构建及用于大鼠皮肤损伤修复的效果分析

目的探讨由人表皮干细胞、成纤维细胞和纤维蛋白支架构建组织工程皮肤(TES)及用于皮肤缺损大鼠损伤修复的效果。方法通过胰蛋白酶消化法分离人表皮干细胞和真皮成纤维细胞,传代培养并与纤维蛋白支架构建TES。取60只适龄无特定病原体级雄性大鼠,建立皮肤缺损模型并随机分成TES组、表皮干细胞支架组、成纤维细胞支架组、支架组和对照组,每组12只。术后2、4、6周观察大鼠移植部位和整体情况,获取组织标本行免疫组织化学检查,并统计各组的皮片成活率、创面愈合率、移植物收缩率、微血管数目等指标。比较各组大鼠术后6周新生皮肤厚度及创面完全愈合时间。结果所有大鼠术后饮食、饮水、排便及排尿正常,均无感染情况出现,顺利完成实验。TES组术后2周便完成新生皮肤生长,术后6周新生皮肤质地、韧性和光滑程度均较好,其余4组术后6周观察创面凹陷、显著收缩、新生皮肤欠平整,各组均无肿瘤性组织生长或炎性组织。术后6周,TES组移植物收缩率、创面愈合率、微血管数目、皮肤厚度均明显高于其余4组,且创面完全愈合时间明显短于对照组和支架组[(28±4)d比(44±6)、(42±7)d](均P<0.05)。各组大鼠术后2、4、6周皮片成活率比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。组织学观察发现,术后6周TES组棘细胞层达3~4层,表皮干细胞达8~10层,可见少量淋巴细胞,血管和成纤维细胞排列有序,数目较多。其余4组术后6周开始出现颗粒层、棘层、基底层,角质层不连续;真皮层成纤维细胞排列无序,数目较多,并可见少量淋巴细胞和血管。结论采用人表皮干细胞、成纤维细胞和纤维蛋白支架构建TES可以帮助缺损皮肤快速修复,并改善愈合质量。

人脱细胞羊膜复合脂肪源性干细胞修复大鼠全层皮肤缺损的实验研究

目的人脱细胞羊膜(human acellular amniotic membrane,HAAM)含胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分,这些成分能为细胞增殖、分化提供丰富营养。研究HAAM与脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的生物相容性,探讨HAAM复合ADSCs构建真皮替代物修复全层皮肤缺损的可能性。方法取健康4月龄SD大鼠30只,雌雄不限,体重250～300g,于腹股沟处获取脂肪行ADSCs体外分离、培养和传代;取第3代细胞行HE染色及CD44、CD49d、CD34免疫细胞化学染色鉴定。应用物理和酶消化法处理自愿捐赠的人羊膜获得HAAM,行HE染色观察细胞是否脱除干净,扫描电镜观察HAAM结构特征。将第3代ADSCs以2×105个/cm2密度接种于HAAM上皮面,体外共培养1～5d后分别行扫描电镜和MTT检测,不加材料组设为对照组。将大鼠随机分为3组,每组10只,建立背部直径为2cm的全层皮肤缺损模型。A组创面植入复合ADSCs的HAAM,B组植入单纯HAAM,C组常规包扎。术后行大体观察,于术后1、2、4周计算创面愈合率,并取创面皮肤行HE染色和细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)免疫组织化学染色观察。结果HE染色示第3代ADSCs呈梭形,胞核为椭圆形,位于细胞中央;免疫细胞化学染色示第3代ADSCs表达CD44和CD49d,不表达CD34。HAAM行HE染色未见细胞残留;扫描电镜下见HAAM两面具有不同的三维结构,上皮面为较致密的网状纤维;基质面为较稀疏的胶原纤维,未见纤维发生融合、断裂和降解。ADSCs-HAAM复合培养3d后扫描电镜下可见细胞生长状态良好,胞体肥大呈梭形隆起,胞膜外绒毛致密略有弯曲,胞体下方形成丰富的伪足牢固黏附于HAAM上;培养1～5d,MTT检测示实验组和对照组吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05)。移植术后1、2、4周,A组创面愈合率均高于B、C组,B组高于C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。HE染色示A组创面愈合速度快于B、C组;A组CK19表达亦明显高于B、C组。结论HAAM复合ADSCs构建真皮替代物对大鼠全层皮肤损具有良好的促愈合作用。

表皮干细胞活性复合皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损

目的用表皮干细胞和成纤维细胞作为种子细胞,研制一种增殖能力强具有表皮、真皮的组织工程化人工复合皮肤。方法从幼儿包皮中分离表皮干细胞,用胶原Ⅳ纯化、富集表皮干细胞,接种在3T3细胞滋养层上,将体外传代培养的表皮干细胞和真皮成纤维细胞分别接种在经冷冻干燥及戊二醛交联的Ⅰ型胶原基质网架的两侧,在液面下培养2周后,改为气-液界面培养,构建复合皮肤,移植到裸鼠全层皮肤缺损处,以表皮细胞胶原海绵复合皮肤和无细胞接种的胶原海绵膜作为对照。术后进行大体观察,在第7、14、21天取材行组织学、免疫组织化学及电镜观察。结果用表皮干细胞构建的复合人工皮肤增殖能力强,新生的皮肤瘢痕轻,形态满意,创面愈合的速度和质量均优于对照组。结论在胶原海绵上用表皮干细胞构建的复合人工皮肤增殖能力强,较好地解决了种子细胞的老化问题,可望成为一种较为理想的皮肤替代物。

诱导多能干细胞作为种子细胞在组织工程皮肤中的应用研究进展

组织工程皮肤在各种皮肤缺损特别是大面积烧伤的临床治疗上具有广泛的应用前景，而种子细胞来源不足及其功能完善是目前该领域面临的主要难题。现有组织工程皮肤种子细胞由于获取、增殖及老化等方面的限制难以满足临床应用的需要。诱导多能干细胞的出现，为组织工程皮肤提供了安全高效种子细胞新来源。本文主要论述诱导多能干细胞的来源及其向角质形成细胞、成纤维细胞、黑素细胞、血管平滑肌细胞、神经元、毛囊分化等特性，并展望其在组织工程皮肤构建与创面修复应用中所面临的主要问题和前景。