In vitro reconstruction and characterization of tissue-engineered human corneal epithelium with seeder cells from an untransfected human corneal epithelial cell line

AIM: To demonstrate the morphology and structure of in vitro reconstructed tissue-engineered human corneal epithelium (TE-HCEP) with seeder cells from an untransfected HCEP cell line. METHODS: The TE-HCEPs were reconstructed in vitro with seeder cells from an untransfected HCEP cell line, and scaffold carriers of denuded amniotic membrane (dAM) in air-liquid interface culture for 3, 5, 7 and 9 days, respectively. The specimens were examined with hematoxylin-eosin (HE) staining of paraffin-section, immunocytochemical staining, scanning and transmission electron microscopy. RESULTS: During in vitro reconstruction of TE-HCEP, HCEP cells formed a 3-4, 6-7 and 8-10 layers of an HCEP-like structure on dAMs in air-liquid interface culture for 3, 5 and 7 days, respectively. But the cells deceased to 5-6 layers and the structure of straified epithelium became loose at day 9. And the cells maintained positive expression of marker proteins (keratin 3 and keratin 12), cell-junction proteins (zonula occludens-1, E-cadherin, connexin 43 and integrin beta 1) and membrane transport protein of Na+-K+ ATPase. The HCEP cells in TE-HCEP were rich in microvilli on apical surface and established numerous cell-cell and cell-dAM junctions at day 5. CONCLUSION: The morphology and structure of the reconstructed TE-HCEP were similar to those of HCEP in vivo. The HCEP cells in the reconstructed TE-HCEP maintained the properties of HCEP cells, including abilities of forming intercellular and cell-extracellular matrix junctions and abilities of performing membrane transportation. The untransfected HCEP cells and dAMs could promisingly be used in reconstruction HCEP equivalent for clinical corneal epithelium transplantation.

组织工程人角膜内皮的体外重建及其形态结构

目的:组织工程人角膜内皮(tissue-engineered human corneal endothelia,TE-HCE)的体外重建及其形态结构。方法:用有限稀释法从HCE细胞系筛选出单克隆细胞(mcHCE细胞),用常规染色体标本制作和核型分类学方法进行核型分析。用羊膜的胰酶倒置消化和细胞外基质蛋白包被方法制备去上皮层修饰羊膜(mdAM)。以核型正常的对数期mcHCE细胞为种子细胞,以平铺于24孔培养板孔底的mdAM为载体支架,用200mL/L胎牛血清-DMEM/F12培养液在37℃,50mL/LCO2培养箱中进行TE-HCE的体外重建。用茜素红染色、冰冻切片HE染色、倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与mdAM结合的紧密程度。用透射电镜方法鉴定种子细胞的超微结构以及细胞连接的形成情况。用免疫荧光技术检测种子细胞对不同细胞连接蛋白的表达模式。结果:从非转染HCE细胞系中筛选出了7个核型正常(2n=46)的单克隆细胞株。在启动重建30h后,mcHCE种子细胞在mdAM上形成了完整的细胞单层,细胞密度高达3413/mm2。HCE细胞呈多角形细胞形态,形成了完整的细胞单层,且在细胞-细胞以及细胞-mdAM间形成了多种细胞连接,种子细胞在超微结构上与在体HCE细胞类似,胞质中含有许多线粒体,并具有紧密连接蛋白-1、钙黏蛋白、间隙连接蛋白-43和整联蛋白αv/β5的阳性表达。结论:体外重建的TE-HCE在结构和功能上与在体HCE相似,有望作为HCE的替代物用于临床角膜内皮移植。

三种组织工程鼓膜的构建

目的构建3种不同材料的组织工程鼓膜,并对其进行生物学特性检测。方法体重30kg健康雄性小白猪1只,制备脱细胞硬脑膜及脱细胞真皮,并从牛皮中提取液态胶原,将第3代豚鼠鼓膜成纤维细胞1×106个/mL,各0.2mL种于3种材料表面进行培养,倒置相差显微镜下观察成纤维细胞的生长状态。培养1周后,将3种材料分别进行扫描电镜及HE染色观察,测定材料厚度及其张力。结果成纤维细胞在3种材料表面生长良好,呈束状平行排列,其中以胶原与脱细胞真皮表面成纤维细胞生长情况较佳。HE染色及扫描电镜下可见成纤维细胞呈单层于3种材料表面连续生长。胶原膜、脱细胞真皮及脱细胞硬脑膜的平均厚度分别为9.4、10.0及10.4μm。张力强度测定,复合成纤维细胞的胶原组织工程鼓膜张力(1.417±0.030)N/mm2,复合成纤维细胞的脱细胞真皮张力为(24.500±2.040)N/mm2,复合成纤维细胞的脱细胞硬脑膜张力为(53.300±2.600)N/mm2;复合成纤维细胞的脱细胞真皮张力与正常豚鼠鼓膜张力26.700N/mm2最接近。结论脱细胞猪真皮为支架复合成纤维细胞构建的组织工程鼓膜,其张力与厚度均与正常豚鼠鼓膜相接近,是构建组织工程鼓膜的理想材料。

成年兔雪旺细胞与医用组织引导再生胶原膜联合培养后植入体内的实验研究

目的 :探索用组织工程方法构建人工神经的可行性。方法 :应用医用组织引导再生胶原膜作为支架与成年兔雪旺细胞培养 2周 ,以雪旺细胞胶原膜复合物的形式修复自体神经缺损。 8周后对所获得的组织工程神经移植物进行形态学研究。结果 :成年兔雪旺细胞在医用组织引导再生胶原膜上生长良好并均匀分布于支架表面 ,形成bungner带 ,且基质分泌旺盛。神经已通过移植物长入远端 ,胶原膜已吸收。结论 :雪旺细胞可以在医用组织引导再生胶原膜上得到扩增 ,形成的三维立体结构具有人工神经的基本特性 ,本研究为组织工程方法修复长段神经缺损打下基础。

PLGA生物膜和延长的神经轴突束构建人工神经的体外研究

目的探索新的构建人工神经的方法,寻找合适的支持周围神经移植的基质材料。方法将鼠胚皮质神经元细胞种在PLGA生物膜支架上,用自制的神经轴突延长装置对其延长。观察神经元细胞及轴突生长情况,测定轴突延长后轴膜的渗透性。同时用免疫组化方法对神经微丝蛋白进行染色。结果鼠胚的神经元和神经轴突束可以在PLGA生物膜上延长和继续培养。这些神经元和延长后的轴突束可以保持正常形态和功能。结论这种复合神经元轴突束的三维支架结构具有人工神经的基本特征。本研究为用延长的神经轴突束修复神经缺损打下基础。