骨髓间质干细胞复合多孔磷酸钙陶瓷修复兔颅骨缺损的研究

目的 探讨以骨髓间质干细胞 (MSCs)作为种子细胞、β-磷酸三钙 (β- TCP)多孔生物陶瓷作为支架材料构建组织工程化人工骨 ,修复兔实验性颅骨标准缺损的可行性。 方法 选择 5月龄新西兰大白兔 34只 ,制作颅骨标准缺损后分成 3组。A组 (n=2 0 ) :分离培养兔同胎异体 MSCs,体外扩增后接种到预制的 β- TCP多孔生物陶瓷材料上 ,细胞 -材料复合体经体外孵育后 ,无菌条件下植入颅骨缺损 ;B组 (n=10 ) :采用单纯β- TCP材料修复兔颅骨缺损 ;C组(n=4 ) :兔实验性颅骨标准缺损区未做骨修复。术后 6周和 12周分别处死动物、取材 ,进行缺损区大体、组织学、组织化学和免疫组织化学分析。 结果 颅骨缺损处 A组术后 6周表面肉眼可见骨样组织形成 ,组织学提示材料部分降解 ,未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生骨组织 ,成骨细胞外基质丰富 , 型胶原染色阳性 ;术后 12周 ,支架材料几乎完全降解 ,缺损区被新生骨组织所取代。B组术后 6周 ,可见从缺损区边缘有新生骨组织向支架材料内长入 ,支架材料部分吸收 ;术后 12周 ,可见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生骨组织逐渐增多 ,但材料的中心部位未发现新生骨形成。C组术后 12周 ,仅见少量骨组织从缺损区边缘向缺损区内长入 ,缺损中央大部分区域未得到修复。

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对间充质干细胞生物学行为的调控

为探讨碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)基因转染对间充质干细胞 (MSCs)增殖、定向分化等生物学行为的调控作用 ,本文将体外具有促进 MSCs增殖分化及毛细血管增殖等多重生物学效应的 b FGF基因转入骨组织工程首选种子细胞—— MSCs,通过免疫组化 SABC法检测其瞬时与稳定表达 ,并检测转基因细胞增殖活力及碱性磷酸酶 (AL P)与骨钙素 (OC)合成情况。结果表明 ,b FGF基因能被转入 MSCs并得到稳定表达 ,转基因细胞增殖与OC合成明显增强 ,AL P活性无明显变化。因此 ,转基因 MSCs可使 b FGF持续高效发挥作用 ,克服了使用外源性b FGF半衰期短 ,需反复大剂量给药的缺点 ;b FGF基因转染可促进 MSCs增殖并调控其定向分化 ,使其获得良好的生物学活性 ;从而为把组织工程学与分子生物学有机结合 ,用分子组织工程学技术高质量地修复骨缺损奠定了良好的基础。

丝素蛋白-壳聚糖支架复合骨髓间充质干细胞体内构建组织工程化软骨的生物相容性

背景:课题组前期的研究中发现,丝素蛋白-壳聚糖支架材料复合诱导后骨髓间充质干细胞在兔体内能修复缺损的软骨组织,但对于该组织工程化软骨组织的生物相容性还未进一步研究。目的:研究丝素蛋白-壳聚糖支架材料复合骨髓间充质干细胞在体内构建组织工程化软骨的生物相容性。方法:使用丝素蛋白-壳聚糖按1∶1比例混合制备三维支架材料,提取兔骨髓间充质干细胞,将诱导后的骨髓间充质干细胞与丝素蛋白-壳聚糖支架构建修复体,再将修复体移植到兔关节软骨缺损模型中修复软骨组织。实验分为3组,实验组植入诱导后骨髓间充质干细胞+丝素蛋白-壳聚糖支架,对照组植入丝素蛋白-壳聚糖支架干预,空白组未植入修复体。结果与结论:①实验成功制备丝素蛋白-壳聚糖三维支架材料及提取骨髓间充质干细胞,并构建软骨缺损的修复体,将修复体植入兔体内能成功修复缺损的软骨组织;②建模后2,4,8,12周,3组血常规、降钙素原、血沉、C-反应蛋白结果提示无明显的全身感染征象,3组血常规及肝肾功能各时间段比较差异无显著性意义(P>0.05);③一般观察、苏木精-伊红染色及扫描电镜观察:建模后12周,相比其他两组,实验组软骨缺损已修复,支架材料已吸收,修复组织周围未见炎性细胞,修复组织已正常组织整合良好;④结果证实,丝素蛋白-壳聚糖支架复合骨髓间充质干细胞在体内构建的组织工程化软骨具有良好的生物相容性。

组织工程骨修复9例颅骨缺损畸形初步报道

目的:探讨利用自体骨髓间充质干细胞(BMSC)作为种子细胞的组织工程骨修复外伤后颅骨缺损畸形的可行性。方法:运用自体BMSC组织工程骨技术,对9例外伤术后颅骨缺损患者行颅骨修复手术。抽取患者自体骨髓,密度梯度离心法分离BMSC,经体外扩增和成骨诱导后,接种部分脱钙骨支架材料,构建组织工程骨。细胞材料复合物体外共培养1周后,手术植入颅骨缺损区。分别于术后1周和3、6、12个月进行临床外形和三维CT检查,随访治疗效果。结果:术后1周三维CT显示,颅骨缺损区被所植入的组织工程骨填充,头颅外形明显改善。术后3至12个月CT显示,组织工程骨形成并修复颅骨缺损,新生骨与骨缺损断端融合。9例患者中2例术后失访,2例高龄患者及大面积骨缺损患者发生不同程度的组织工程骨吸收现象,其余均良好地修复了颅骨缺损。结论:通过选择适宜的病例,以自体BMSC作为种子细胞,运用组织工程技术可以在人体内形成稳定的组织工程化骨并修复颅骨缺损。

胶原蛋白海绵复合种子细胞对兔尺骨缺损的修复效果

目的研究以胶原蛋白海绵为支架复合骨髓间充质干细胞(BMSCs)和成骨细胞(OB)体外构建的组织工程骨修复兔尺骨骨缺损的能力。方法新西兰大白兔27只,制备双侧尺骨中段1.5 cm节段性骨缺损模型,按植入的修复物随机分成3组,每组9只。A组为胶原蛋白海绵复合OB,B组为胶原蛋白海绵复合BMSCs细胞,C组为胶原蛋白海绵复合OB和BMSCs细胞,D组为胶原蛋白海绵,作为自身对照。每组植入物植入前在体外培养1周,术后4、8、12周每组分别取3只动物,进行X线检查、大体标本观察和HE染色组织学观察,比较4组骨缺损的修复情况。结果C组的成骨效果在任何时间检测点均优于其他组(均P<0.05),表现出更好的骨质量、更高的X线得分和更大数量的骨体积。A组和B组X线得分、新生骨体积差异无统计学意义(均P>0.05),但均高于同时间点的D组。12周时新生骨组织几乎接近正常骨组织,髓腔再通;A组和B组12周时骨缺损区仍处于改建塑形期,D组只有少量骨痂形成,骨不愈合。结论OB和BMSCs两种细胞混合复合胶原蛋白海绵修复兔尺骨节段性缺损的效果最佳,为骨组织工程种子细胞的选择提供了参考,有望成为组织工程修复骨缺损的治疗方法。

复合磷酸三钙/转血管生成素-1的骨髓间充质干细胞对骨修复及血管形成的实验研究

目的 研究转染Ang-1基因的骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合磷酸三钙(TCP)对骨缺损的修复及血管形成作用。方法 脂质体介导质粒pEGFP-N1-hAng-1转染兔BMSCs,与TCP复合,修复兔桡骨1.5 cm缺损模型。分别在2、4、8、12周取材,以组织学、免疫组化、核素扫描等方法检测骨修复及血管再生状况。结果组织学检查见转染细胞组毛细血管生长及新骨形成活跃,术后8、12周骨小梁体积(TBV％)由对照组21.67±6.28和40.18±9.57升至实验组42.17±8.93和67.54±15.29(P<0.05)。微血管密度(MVD)则由对照组10.18±3.54、14.28±5.03升至实验组15.23±5.67、19.64±6.47(P<0.05)。实验组99m锝(Tc)放射性计数在术后4、8、12周达到68.39±21.43、85.52±26.68、98.64±29.28,与对照组37.54±12.36、55.23±18.85、75.67±26.39组间差异有显著性(P<0.05)。结论 Ang-1转染细胞组较对照组血供加强,骨修复加速。与细胞因子局部定向释放,加强血管形成及骨代谢有关。利用基因转染技术结合组织工程有助于深入加强骨缺损的修复研究。

组织工程骨膜同种异体体内成骨修复兔肩胛骨缺损的初步研究

目的 以兔BMSCs和猪小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）复合构建组织工程骨膜，植入同种异体兔体内修复肩胛骨缺损，探讨组织工程骨膜修复大块不规则骨缺损的可行性。 方法取2周～1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs，取猪近端空肠制备SIS，两者复合构建组织工程骨膜。取6月龄新西兰大白兔18只制备单侧肩胛骨3 cm × 3 cm次全切骨缺损模型，随机分为实验组和对照组（n=9），分别于缺损处植入组织工程骨膜和单纯SIS。术后观察动物大体情况；8周时处死动物后行X线片观察并按Lane-Sandhu X 线片评分标准评分；标本大体观察后，行HE及Masson染色观察。 结果实验动物术后进食、活动均正常，切口无红肿、渗液。X线片观察示实验组骨缺损区有片状新生骨形成，密度与正常骨相同；对照组骨缺损区无骨形成征象，骨缺损区密度与周围软组织影相似。X线片评分实验组为（6.67 ± 0.32）分，对照组为（0.32 ± 0.04）分，比较差异有统计学意义（t=19.871，P=0.001）。标本大体观察示实验组两端桥接部已形成骨性愈合，部分骨缺损区被新生骨填充；对照组无骨组织生成。HE及Masson染色示实验组骨缺损处有新骨生成，骨组织中可见血管腔及髓腔样结构，未见明显巨噬细胞及淋巴细胞浸润；对照组骨缺损区仅为胶原瘢痕组织和纤维样结构，无骨组织生成。 结论以兔BMSCs和猪SIS构建的组织工程骨膜在同种异体兔体内可以成骨，具有修复大块不规则骨缺损的可行性。

转染Ang-1间充质干细胞加强兔骨缺损修复的实验研究

目的研究转染血管生成素-1(angiopoiten-1,Ang-1)基因的骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)对兔骨缺损的修复作用。方法以脂质体介导pCDNA3-Ang-1质粒转染体外分离培养的兔BMSCs,与TCP陶瓷复合,修复兔桡骨15mm长节段性骨缺损。以未转染细胞作对照,进行电镜、组织学及核素扫描等方法检测骨修复情况。结果细胞与TCP材料复合后生长良好。组织学检查见转染细胞组毛细血管生长及新骨形成活跃,核素扫描见实验组局部血供丰富、代谢旺盛。结论Ang-1转染细胞组血供增加和骨修复加速,与细胞因子局部定向释放,加强血管形成及骨代谢有关。Ang-1修饰的BMSCs预构人工骨有助于加速骨缺损的修复。

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。

聚乳酸羟基乙酸共聚物支架负载骨髓间充质干细胞修复兔半月板缺损

目的探讨聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)支架复合骨髓间充质干细胞(BMSCs)修复半月板缺损的效果。方法提取兔BMSCs并体外扩增,载入PLGA支架。12只兔随机分为3组,构建单侧膝关节半月板缺损模型,分别对缺损采取旷置(模型组)、植入PLGA支架(PLGA组)或PLGA/BMSCs(PLGA/BMSCs组)的处理,以对侧未造损膝关节的半月板为对照组。术后12周采集半月板样本,进行大体观察、二甲基亚甲基蓝(DMMB)染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及酶联免疫吸附试验(ELISA),以评估半月板修复效果。结果与模型组比较,PLGA组和PLGA/BMSCs组在大体观察中显示出更饱满的缺损填充;该2组的修复组织在DMMB染色中也显现更高的蛋白多糖含量,尤其是PLGA/BMSCs组的蛋白多糖填充更为致密。3个干预组修复组织的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色强度均高于对照组。ELISA显示,PLGA/BMSCs组的Ⅱ型胶原表达(5.216±0.345)均显著高于对照组(4.409±0.284)和PLGA组(4.498±0.452,F=7.093,P<0.05)。结论在半月板缺损植入PLGA支架可以促进修复组织填充缺损;PLGA支架可以支持BMSCs的纤维软骨分化,而植入PLGA/BMSCs构建体较PLGA支架更加有助于进一步增进半月板修复组织中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原组分的生成。

基质细胞衍生因子-1过表达质粒修饰BMSCs联合丝素/胶原蛋白支架在膝关节软骨缺损动物模型中的修复作用

目的探究基质细胞衍生因子-1(SDF-1)过表达质粒修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合丝素/胶原蛋白支架在膝关节软骨缺损动物模型中的修复作用。方法利用蚕丝和胶原蛋白为原材料,构建丝素/胶原蛋白支架,利用SEM显微镜观察其内部结构,并检测支架强度。以新西兰大白兔为研究对象,提取和培养兔源性BMSCs,并且构建SDF-1的过表达载体质粒,通过慢病毒转染BMSCs,通过构建新西兰大白兔的软骨缺损模型,根据是否转染SDF-1过表达质粒分成4组,即模型组、单纯支架组、支架+BMSCs组和支架+SDF-1修饰BMSCs组。利用HE染色和免疫组织化学染色检测软骨缺损的修复作用。结果丝素蛋白/胶原蛋白支架的水平牵拉力和垂直挤压力强度要明显高于单一丝素蛋白支架。支架+SDF-1修饰BMSCs组的修复效果要明显优于模型组、单纯支架组和支架+BMSCs组;支架+SDF-1修饰BMSCs组中II型胶原蛋白的表达量要明显高于模型组、单纯支架组和支架+BMSCs组,说明支架+SDF-1修饰BMSCs组的软骨缺损修复效果好。结论支架+SDF-1修饰软骨缺损模型BMSCs具有更佳的修复效果。