番茄花叶病毒移动蛋白和番茄抗病基因Tm-2^2的互作诱导烟草转化体程序性细胞死亡

番茄的抗病基因Tm -2 2 与番茄花叶病毒 (ToMV)的移动蛋白MP基因是一对互作的基因 ,Tm- 2 2 基因和ToMV MP基因同时在烟草中表达 ,并分别获得单一基因整合的纯合转化体植株。病毒接种试验表明 ,Tm -2 2 基因转化体与Tm- 2 2 番茄对Tobamavirus病毒的特异抗性结果一致 ;Tm -2 2 转基因植株和ToMV MP转基因植株杂交试验及其农杆菌注射试验均证明 :(1)Tm -2 2 基因与ToMV- MP在转基因烟草上保持“基因对基因”的互作关系 ;(2 )在外源乙烯的参与下 ,ToMV的移动蛋白与Tm -2 2 基因编码蛋白的互作能够诱导转化体程序性细胞死亡。这一结果为今后研究Tm -2 2 与MP互作的分子机制奠定了基础。

番茄Tm-2^2基因在烟草中的表达及其对番茄花叶病毒（TOMV）的特异抗性

Tm-22基因在烟草上的转化和表达表明,Tm-22基因在同科不同属植物体上的功能没有改变。在两种类型的纯合转化体上,Tm-22基因编码蛋白能够抗Tobamovirus属5种不同的毒株,并能被ToMV-2a毒株感染而失去抗病性。这个结果表明:移动蛋白上的氨基酸变异能够影响R蛋白对ToMV的应答反应。Tm-22基因转化体在不同启动子的调控下,对ToMV-2a毒株感染所表现的症状不同,说明启动子在Tm-22基因的抗病反应中具有非常重要的作用。

转番茄Tm-2^2基因烟草T2代植株的生物学性状变异

Tm-22基因转化烟草并获得表达,表明Tm-22基因的功能在同科不同属的植物体上没有改变.但是转基因烟草的T2代出现了许多生物学性状的变异,例如,无花粉花药、花瓣呈浅色、植株体矮化、种苗黄化等,这种变异性状的产生不仅有外源基因重组的因素,也是该基因与其它基因相互作用的结果.这些变异的个体为研究该基因的功能及其遗传变异规律提供了丰富的材料.

大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(Gm VTE3)的克隆及对转基因烟草种子中生育酚组成的影响

【目的】克隆大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(GmVTE3),研究其在烟草中过量表达对转基因烟草种子中生育酚(维生素E)组分的影响。【方法】利用EST拼接和RT-PCR技术,从大豆中分离了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(VTE3)的全长cDNA序列,通过烟草转化研究过量表达VTE3对转基因植株维生素E组分的影响。【结果】GmVTE3全长1026bp,编码342个氨基酸,与其它物种的VTE3氨基酸同源性很高,在烟草中过量表达该基因使烟草种子中γ-生育酚与δ-生育酚的比值最高增加2倍。【结论】首次克隆了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因GmVTE3,它能够催化烟草植株中2-甲基-6-植基-1,4-苯醌(MPBQ)的甲基化,从而改变烟草种子中生育酚的组成成分。说明可以利用克隆的GmVTE3来改变植物种子中生育酚的组成和提高α-生育酚的含量。

传染性法氏囊病病毒VP2基因在转基因烟草中的初步表达

将鸡传染性法氏囊病病毒TS株VP2基因置于植物组成型表达启动子CaMV 35S之下,构建了IBDV VP2基因的表达载体pBR-VP2,经根瘤农杆菌介导法将VP2基因整合到烟草基因组中,Northern杂交结果表明,转基因烟草中存在IBDV VP2基因的mRNA;Dot-ELISA和Western blotting检测表明IB-DV VP2基因在烟草中得到了表达。

番茄抗病基因Tm-2^2及其等位基因氨基酸序列的比较

从4个番茄栽培品种（Lycopersicon esculentum Miller）中获得了Tm-2^2等位基因的同源克隆，进行序列分析，结果表明：‘沙龙’、‘渝抗2号’和‘97-4’分别与‘GCR-267’（Tm-2^2）、‘GCR-236’（Tm-2）、以及‘GCR-26’（tm-2）有100％的同源性，而樱桃番茄（Lycopersicon peruvianum．var．cerasiforme）品种‘樱红1号’与‘GCR-26’（tm-2）仅有98％的同源性；在C-端的LRR结构域中，抗病基因Tm-2。和Tm-2编码蛋白的氨基酸序列与感病基因tm-2存在624和704两个位点的氨基酸差异，即624位点的脯氨酸（P）对应亮氨酸（L）、704位点的甲硫氨酸（M）对应异亮氨酸（I）；在601—790个氨基酸的LRR结构域中，抗病基因Tm-2、Tm-2及其秘鲁种（Lycopersicon peruvianum var．dentatum）lptm-2三者均与感病基因tm-2的编码蛋白存在23个氨基酸的差异；樱桃番茄品种‘樱红1号’与含有tm-2基因的栽培种之间具有同源性关系。

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

【目的】本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T_1代转基因抗CMV株系。【方法】构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b(r)-In-2b(i),以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草(Nicotiana tabacum)品种云烟85。【结果】抗性筛选获得112株T_0代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T_0代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T_0代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T_0代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T_1代抗病性,发现部分T_1代烟株发生一定比例的抗感分离,T_1代抗性株率为46.7%～100%。Real-time PCR检测T_1代烟株,发现T_1代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。【结论】基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。

phaC1、phaC2基因双价植物表达载体的构建及其转基因烟草的获得

利用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从类产碱假单胞菌YS1(PseudomonaspsuedoalcaligeneseYS1)染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因 :phaC1、phaC2基因。同时利用套叠PCR技术对 phaC1基因进行了改造 ,经过基因拼接构建了植物表达载体pC3C1(嵌合phaC1)、pC3C2 (嵌合 phaC2 )和 pC3C1C2 (嵌合 phaC1和 phaC2双基因 )。将构建好的嵌合 phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体 pC3C1C2 ,用冻融法转入根癌土壤杆菌 (AgrobacteriumtumefaciensEHA10 5 )并且通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草 (NicotianatobacumHonghuadajinyuan)。 2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株 ,抗性植株大田生长表型正常 ,生长速度相对缓慢。抗性植株经过PCR、PCR Southern、Southern检测初步确定有 32 %烟草稳定整合了 phaC1和 phaC2。用氯仿 -次氯酸钠直接从部分Southern检测阳性转化植株中抽提纯化得到PHA ,在产物合成水平确证有 2 5 6

转2mG2-epsps基因烟草的草甘膦耐受性分析

利用农杆菌介导法将耐草甘膦基因2mG2-epsps转入烟草,获得87株PCR阳性植株,阳性率为43%。对PCR阳性植株进行Southern杂交、RT-PCR、Western杂交和ELISA分析,结果显示外源基因已经整合到烟草基因组中并高效表达,转基因植株的叶片中2mG2-EPSPS蛋白的最高表达量可达26.03μg/g鲜重。转基因烟草草甘膦耐受性分析显示,其中有15个转化事件表现出较好的草甘膦耐受性,对草甘膦的耐受性可达到1%。转基因植株的种子可以在10 mmol/L草甘膦异丙铵盐浓度下萌发,T1代转基因烟草幼苗可以耐受浓度为0.8%的草甘膦。研究结果表明转2mG2-epsps基因烟草具有较高的草甘膦耐受性,2mG2-epsps基因可以用于耐除草剂转基因作物的培育。

过表达秋茄C2H2型锌指蛋白基因KcZFP提高烟草耐盐性

基因转录调节是植物对非生物胁迫适应机制的一个重要方面,转录调节因子在胁迫信号转导途径中调节下游基因的表达,在建立植物对胁迫适应性过程中起到重要作用。锌指蛋白是功能多样的转录调节因子蛋白家族,家族成员在植物响应非生物胁迫方面扮演着重要角色。本研究以秋茄C2H2型锌指蛋白编码基因KcZFP为目的基因,在烟草中过表达KcZFP,分析C2H2型锌指蛋白在植物耐盐性中的作用。研究结果显示:转基因株系中,KcZFP表达量显著提高。过表达KcZFP的烟草植株的耐盐性明显提高,在200mmol/LNaCl处理的条件下,KcZFP过表达烟草中脯氨酸水平远高于野生型植株。对光合作用参数比较分析显示,在KcZFP过表达植株中净光合速率受盐胁迫的影响小于野生型植株,光合系统在一定程度上得到了保护。研究结果说明KcZFP作为转录调节因子参与了植物的渗透调节,对植物的耐盐性具有贡献。

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草植株的抗病性分析

将人工合成的与苜蓿花叶病毒(ALMV)RNA_2互补的寡核苷酸进行放射性同位素(γ-P^(32)ATP)标记,制备成探针。用ALMV攻毒转基因烟草和未转基因烟草,提取总RNA,用上述探针分析植珠体内病毒增殖情况,做抗病性分析。实验表明:转基因植珠(李颖同学做的转基因植株)有较强的抗病性,而未转基因的对照株却无抗病性。

转PvP5CS2基因烟草对干旱胁迫的反应

为了验证普通菜豆脯氨酸合成酶基因PvP5CS2在改善作物抗旱性方面的作用,构建了普通菜豆PvP5CS2基因的烟草表达载体pCAPE2-PvP5CS2,利用农杆菌将PvP5CS2导入烟草,获得15株阳性转PvP5CS2基因植株。干旱胁迫条件下,转基因烟草植株和野生型植株叶片中脯氨酸含量、叶片相对含水量和萎蔫叶片数的差异均达到极显著水平。转基因烟草的脯氨酸含量、叶片相对含水量分别是野生型的2.30倍和1.26倍,而萎蔫叶片数只相当于野生型的90%。表明超表达PvP5CS2基因的烟草植株在干旱胁迫条件下能积累较多的脯氨酸,抗旱性得到初步改善。

拟南芥AVP2基因转化烟草中吸钾相关基因的转录分析

【目的】了解无机焦磷酸酶对植物钾吸收和相关基因表达的作用。【方法】反转录克隆拟南芥无机焦磷酸酶基因(H+-PPase)AVP2,构建植物表达载体,采用根癌农杆菌介导法将其导入烟草品种K326,经分子鉴定,提取转化烟苗幼根RNA,反转录后,应用荧光定量PCR分析外源基因AVP2和烟草钾通道基因NKT1、钾离子转运体基因NtHAK1、细胞质膜H+-ATPase基因NHA1、液泡膜H+-ATPase基因VAG1和液泡膜H+-PPase基因NVP1的mRNA转录水平,并测定转化烟草叶片的内在化学成分。【结果】获得了GUS染色和AVP2序列PCR扩增呈阳性的卡那霉素抗性转化烟草11株。经Southern杂交鉴定,证实AVP2基因已成功导入烟草,在转化烟草幼根中可以检测到外源基因AVP2的mRNA,证实该基因已整合到烟草基因组并成功表达;与未转化烟草相比,烟草钾离子转运体基因NtHAK1的转录水平显著增加,钾通道基因NKT1的转录稍有增加,而烟草液泡膜H+-ATPase基因VAG1和液泡膜H+-PPase基因NVP1的转录有所降低,烟草细胞质膜H+-ATPase基因NHA1无显著变化;转化烟草材料烟叶K+含量较对照显著增加,而烟碱、还原糖等其他内在化学成分无显著变化。【结论】无机焦磷酸酶基因参与植物的K+吸收。

Pt-mVirD2-GUS质体蛋白编码基因的合成及转化烟草的研究

将拟南芥冷调节基因AtCor15A的质体定位信号肽编码序列、丧失了核定位信号序列的根癌农杆菌VirD2基因突变序列mVirD2和GUS基因序列,拼接成pt-mVirD2-GUS嵌合基因,由CaMV35S启动子和Tons终止子控制,并经根癌农杆菌介导,成功导入了烟草基因组。

人干扰素α-2b基因在烟草中的表达研究

应用PCR的技术从质粒pAIFN中扩增人干扰素α-2b(Human interferon α-2b,HuIFN α-2b)编码基因,将其连接到pBI121双元载体构建植物真核表达载体pBIFN;用冻融法将该载体转染根癌农杆菌LBA4404;并用叶盘浸染法转化烟草叶片,经转化的烟草叶片的组织培养,诱导愈伤获得再生植株。通过应用PCR,RT-PCR,Wes-tern blot和WISH/VSV方法检测获得的烟草再生植株,结果表明HuIFN α-2b基因已成功整合进烟草核基因组并表达出具有活性的HuIFN α-2b蛋白。本文对HuIFN α-2b基因在烟草核系统中的表达进行了研究,为进一步在烟草叶绿体系统中该基因的表达研究奠定了基础。

丙肝病毒E2基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

丙型肝炎病毒（HCV）是导致全世界1．8亿患者急慢性肝炎的主要原因，目前还没有可利用的疫苗和有效的治疗措施。人的HCV包膜蛋白是HCV原型疫苗的吸引人的部分，目前在遗传工程领域的发展允许利用植物作为工厂生产外源蛋白。在这一研究中，构建了丙型肝炎病毒E2基因的植物表达载体，通过农杆菌介导转化烟草。经PCR和Southern blot检测，目的基因已整合到转基因植株的基因组中。为抗HCV植物疫苗的研究奠定的基础。

转cry2Ab4和vip3Aa11基因烟草对小地老虎杀虫效果研究

小地老虎严重危害农业生产,通过转基因技术提高作物对小地老虎的杀虫效果是一条切实可行的途径。cry2Ab4和vip3Aa11是从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)中克隆到的两个杀虫基因。分别构建了pCS2Ab和pCSvip3A两种植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)NC89,并得到32株和35株阳性转基因植株。通过对其进行RT-PCR分析、Western杂交分子检测证实两种外源基因在烟草植株中可以正常表达。人工饲喂初龄小地老虎幼虫,对两种转基因植株进行生物活性检测,结果显示饲喂转基因叶片的小地老虎幼虫死亡率在82%以上,抗虫能力比对照显著提高,转vip3A植株抗虫效果优于转cry2Ab植株。

硫酸钡比浊法测定烟草中硫酸根(SO_4^(2-))离子

烟草中硫酸根离子的含量会影响其燃烧性、质量和吃味。为快速准确大量地测定烟草中硫酸根离子的含量,本文介绍了硫酸钡(BaSO_4)比浊法测定烟草中硫酸根离子的方法。将烟草样品进行干灰化后制成待测液,定容至100 mL,在弱酸性条件下,SO_4^(2-)和BaCl_2作用生成溶解度很小的BaSO_4白色沉淀。浓度在2～40mg/L范围内,其浑浊度与溶液中SO_4^(2-)浓度成正比,通过比浊法即可测定溶液中的SO_4^(2-)浓度。

大豆PM2蛋白及其结构域可提高烟草耐盐性

深圳市微生物基因工程重点实验室已利用大肠杆菌异源表达体系证明了大豆PM2蛋白(LEA3)的耐盐功能,并首次证实PM2蛋白序列中的22-氨基酸结构域(PM2B)为一主要耐盐结构域．为在高等植物中进一步验证PM2蛋白及22-氨基酸结构域的耐盐功能,将大豆PM2及PM2B基因克隆至植物表达载体pBI121,并利用农杆菌侵染法转化烟草叶盘,通过PCR扩增法鉴定转基因植株．结果表明PM2及PM2B基因已整合至转基因烟草的基因组DNA中,转化率分别为44．4％和62．5％．与含1．5％(质量分数)NaCl的培养基比较,转基因烟草植株的生长状况和叶片的叶绿素含量,结果表明转PM2和PM2B基因的烟草耐盐性明显高于对照(转化pBI121载体)植株．这说明转PM2和PM2B基因可提高烟草的耐盐能力．可见,PM2蛋白及22-氨基酸结构域在原核和真核细胞中的耐盐保护作用可能是相似的．

由基因序列开发番茄枯萎病抗性基因I-2的共显性分子标记

根据I-2的基因序列设计特异扩增引物对I-2/5F和I-2/5R,扩增I-2基因3132～3765bp之间片段,基因型为I-2/I-2的材料03F-7可扩增出633bp的条带,而基因型为i-2/i-2的材料Moneymaker可扩增出693bp的条带,杂合型材料可扩增出以上2个条带。通过这两个特异扩增片段的克隆和测序证明,抗病材料扩增的633bp片段为I-2基因的3132～3765bp之间的序列,而感病等位基因中出现大量的碱基突变和60bp片段插入。利用引物对I-2/5F和I-2/5R,可区分纯合抗病材料、杂合抗病材料和纯合感病材料,从而建立了I-2基因的共显性分子标记。在此基础上,利用该标记对16个主要番茄品种进行基因型鉴定,8个品种含有I-2基因,其中1个品种基因型为I-2/I-2,其他品种为I-2/i-2。通过一次PCR和一次HindⅢ酶切建立了I-2和Tm-22双基因检测体系,为多基因鉴定及标记辅助选择提供了有力工具。