尼罗罗非鱼跨膜Bax抑制剂母体6基因Tmbim 6的克隆、表达及功能鉴定

为了解跨膜Bax抑制剂母体6(transmembrane Bax inhibitor motif containing 6,TMBIM 6)在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)病原体感染中的作用,利用聚合酶链式反应(PCR)对Tmbim 6基因进行克隆与鉴定,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)分析Tmbim 6在健康尼罗罗非鱼(体质量为80~100 g)的组织分布模式及无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、Poly I:C模拟病毒刺激后的表达变化。结果表明:尼罗罗非鱼Tmbim 6开放阅读框为714 bp,可编码237个氨基酸,包含6个跨膜结构域和1个C-末端基序;亚细胞定位显示,尼罗罗非鱼TMBIM 6定位于细胞质,双荧光素酶报告基因系统检测发现,Tmbim 6在HEK-293T细胞中过表达后极显著抑制NF-κB通路(P<0.01);qPCR分析显示,Tmbim 6基因在所检测的组织中广泛分布,在肝脏和肌肉中的表达量最高;经无乳链球菌感染和Poly I:C刺激后,Tmbim 6在肝脏、脾脏、头肾、脑和肠道中的表达水平均显著上调(P<0.05)。研究表明,尼罗罗非鱼TMBIM 6参与了无乳链球菌感染和Poly I:C刺激后的细胞应激过程及免疫反应。

山慈菇提取物对肝癌细胞Huh7增殖、凋亡的影响及其机制

目的探讨山慈菇提取物(CAE)对肝癌细胞Huh7增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法体外培养Huh7细胞,使用不同浓度(10、20、30 mg/mL)CAE处理24 h;采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR法检测miR-329-3p及含跨膜Bax抑制剂的母体6(TMBIM6)mRNA表达,Western blotting法检测TMBIM6及Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表达。双荧光素酶报告实验验证miR-329-3p与TMBIM6的靶向关系。将细胞分为CAE+anti-miR-329-3p组、CAE+anti-miR-NC组,分别转染miR-329-3p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-329-3p)及其阴性对照(anti-miR-NC),并加入含有30 mg/mL的CAE处理24 h。参照上法检测细胞存活率、细胞凋亡率、miR-329-3p表达、TMBIM6及凋亡相关蛋白表达。结果随着加入CAE浓度的升高,细胞存活率、TMBIM6 mRNA及蛋白、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达均逐渐降低,细胞凋亡率、miR-329-3p表达、p21及Bax蛋白表达均逐渐升高(P均<0.05)。双荧光素酶报告实验结果显示,miR-329-3p能够靶向结合TMBIM6。与CAE+anti-miR-NC组比较,CAE+anti-miR-329-3p组细胞存活率及TMBIM6、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达升高,细胞凋亡率、miR-329-3p表达及p21、Bax蛋白表达均降低(P均<0.01)。结论CAE可抑制肝癌细胞Huh7增殖、促进细胞凋亡,其机制可能与激活miR-329-3p表达并负向调控其靶基因TMBIM6有关。

miR-27b-3p调控TMBIM6对A549细胞凋亡影响

目的 miR-27b-3p在抑制肺癌细胞的增殖中发挥抑癌基因作用,而跨膜Bax抑制剂的母体6(transmembrane Bax inhibitor motif-containing 6,TMBIM6)作为抗凋亡蛋白发挥促癌作用。miR-27b-3p是否调控TMBIM6参与了肺癌细胞凋亡有待进一步探讨。本研究探讨miR-27b-3p靶向调控TMBIM6对非小细胞癌A549细胞的生物学行为的影响。方法细胞实验:以不同肺癌细胞株A549、H1975、H1650和人正常肺上皮细胞BEAS-2B为研究对象;RT-qPCR检测miR-27b-3p表达,双荧光素酶实验检测miR-27b-3p和TMBIM6的靶向关系;脂质体法向A549细胞转染miR-27b-3p mimics和mimics NC后,平板克隆和MTT法检测A549增殖能力,AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测对凋亡的影响。动物实验:采用皮下移植方法建立60只A549裸鼠移植瘤模型,瘤内定点注射miR-27b-3p agomir或者agomir NC,3周后统一处死各处理组裸鼠,测量肿瘤质量,并采用TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡的情况;蛋白质印迹法检测各组细胞和组织中TMBIM6、calpain-2、caspase-12和Bcl-xL蛋白表达。结果细胞实验:miR-27b-3p表达水平在A549(1.44±0.07)、H1975(2.82±0.08)、H1650(4.04±0.11)和Beas2B细胞(14.44±0.20)中差异有统计学意义,F=2 180.00,P<0.05。与人正常肺上皮细胞相比,A549、H1975和H1650中miR-27b-3p表达水平降低,均P<0.05;且A549细胞中miR-27b-3p表达水平低于H1975和H1650细胞,均P<0.05。双荧光素酶实验结果显示,在TMBIM6野生型3′UTR中,miR-27b-3p mimics组荧光素酶的活力值(0.52±0.07)低于mimics NC组(0.98±0.04),差异有统计学意义,t=15.97,P<0.05;提示TMBIM6是miR-27b-3p的直接靶点。与mimics NC和空白对照组相比,miR-27b-3p mimics转染组细胞的增殖率下降,P<0.05;而凋亡率升高,P<0.05。动物实验:与agomir NC组〔(909.30±8.21)mg〕和空白对照组〔(908.20±10.64)mg〕相比,miR-27b-3p agomir组剥离肿瘤的质量〔(398.70±7.54)mg〕减少,F=1 095.00,P<0.05。TUNEL法检测结果显示,miR-27b-3p agomir组组织中细胞凋亡率〔(67.01±3.48)%〕高于agomir NC〔(12.33±1.36)%〕和空白对照组〔(15.97±0.98)%〕,F=188.40,P<0.05。蛋白质印迹结果表明,在A549细胞或者肿瘤组织中过表达miR-27b-3p,calpain-2和caspase-12表达均升高,均P<0.05;而TMBIM6和Bcl-xL表达均降低,均P<0.05。结论 miR-27b-3p靶向抑制TMBIM6表达,激活calpain-2/caspase-12信号通路促进非小细胞肺癌细胞凋亡。