沙雷氏Z4菌株Tn5转座突变株的群体淬灭活性筛选体系的建立及优化

利用Tn5转座子插入突变技术构建沙雷氏Z4菌株突变体库,研究不同因素对转座突变的影响,在此基础上初步探究了突变株的群体淬灭能力.结果表明,采用双亲本接合法,选择对数生长期的沙雷氏Z4菌株与大肠杆菌S17-1(pRL1063a)菌液1∶1混合,30℃培养3 h后,涂布于含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL四环素的LB固体培养基上,长出的突变株数量最多;随机选择突变株进行群体淬灭能力测试,结果筛选到了3株群体淬灭能力明显与沙雷氏Z4野生型有差异的突变株.本研究采用的Tn5转座突变技术为研究群体淬灭菌的基因功能以及生理代谢提供了有效的分子遗传工具,也为研究群体淬灭提供了新的途径.

Tn5转座突变技术在革兰氏阴性细菌分子遗传研究中的应用

随着广宿主载体系统的发展,Tn5及其衍生载体已经广泛应用于革兰氏阴性细菌的分子遗传学研究。主要综述了Tn5转座突变技术在生防细菌生防机理研究、细菌必需基因的鉴定、病原细菌毒力相关基因研究、代谢调控基因研究和菌株的遗传改良方面的应用研究进展。

利用Tn5型转座突变系统筛选高产阿维菌素菌株

目的:转座突变技术是发现新功能基因和获得高产天然产物菌株的一种有效策略。通过理性设计和构建Tn5型转座突变系统,并将其应用于阿维链霉菌,筛选高产阿维菌素的工程菌株。方法:在转座突变载体pUCTN转座插入片段的上游和下游分别引入链霉菌常用的强启动子kasOp*和P21,强化插入位置上游和下游基因的转录表达;在插入片段两端分别添加双向转录终止子T1和T2,有效终止插入序列两端靶基因的转录,引入强启动子和终止子的目的在于增强对转座突变株生理代谢活动的扰动。结果:通过优化供体菌和受体菌的比例,转座效率显著提高。随机选择500株转座突变株进行发酵和阿维菌素产量测试,筛选到3株突变株的阿维菌素产量明显高于出发菌株产量的50%以上。结论:Tn5转座突变系统为研究阿维链霉菌的基因功能和生理代谢提供了有效的分子遗传工具。

玉米联合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A转座突变体系的构建

【背景】长期以来,农业生产上过度施用化学氮肥造成了农田生态环境的破坏,引起土壤板结、次生盐渍化和重金属污染。此外,由于田间大量的氮素流失和淋溶导致水体富营养化和地下水污染,使得农产品硝酸盐含量超标,最终可能通过食物链危及人类的健康。因此,通过合理地开发和利用生物固氮菌,从而减少化学氮肥施用量,对于保护生态环境,促进农业的可持续生产具有十分重要的意义。【目的】对从玉米根部分离得到的联合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A进行Tn5转座突变,从而创制大量的突变体,经筛选后应用于对固氮及其调控的分子机制和氮代谢调控网络解析等研究。【方法】以固氮菌K.radicincitans GXGL-4A为研究对象,通过PCR法克隆得到GXGL-4A菌株的亚硝酸还原酶基因nirBD。通过构建重组质粒pMOD-egfp-tet,并利用电击转化法将转座复合体导入GXGL-4A野生株,进行Tn5转座突变,从而获得大量突变菌株。【结果】筛选到4株亚硝酸盐还原酶活性显著降低的突变株,并克隆了突变株M36突变位点的侧翼序列。【结论】对玉米联合固氮菌K.radicincitans GXGL-4A进行Tn5转座突变是可行的,初步建立了该菌株稳定有效的插入突变技术体系。

广藿香青枯病菌致病相关基因的筛选及分析

目的对广藿香青枯病菌致病相关基因进行筛选及分析。方法以广藿香青枯病菌菌株PRS-84的Tn5转座子插入突变株为材料,通过伤根浸泡法分别接种于广藿香植株,筛选致病性减弱的突变株;对筛选获得的突变株进行生长速率、泳动性和生物膜形成等表型分析;再利用反向PCR扩增致病性减弱突变株Tn5转座子插入位点的侧翼序列并进行序列测定与生物信息学分析。结果筛选得到了2个致病性减弱的突变株(PRS-84-11-33、PRS-84-11-123),它们对广藿香植株的致病性均明显低于野生株PRS-84。与野生株相比,致病性减弱突变株的菌落形态无明显变化,突变株PRS-84-11-123在培养后期生长速率有所升高。突变株PRS-84-11-33及PRS-84-11-123的泳动能力及生物膜形成能力均低于野生株。突变株Tn5转座子插入位点侧翼序列的生物信息学分析表明,这2个致病性减弱突变株的Tn5转座子插入位点基因分别为lptE基因和lon基因。结论该研究筛选获得了与广藿香青枯病菌致病性相关的基因,为了解青枯病菌的致病机制、寻找有效防治广藿香青枯病的方法提供了基础信息。