分子生物学技术在弓形虫病诊断中应用的研究进展

综述了限制性片段长度多态性技术(RFLP)在刚地弓形虫虫株分类方面的应用情况,从PCR、DNA探针技术和基因重组技术方面介绍了用于检测弓形虫DNA的分子生物学技术的研究进展,叙述了编码弓形虫主要蛋白基因的克隆及其表达产物在ELISA诊断中的应用。

弓形虫腺苷激酶基因的克隆、表达及多抗血清的制备

目的克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA。设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓形虫AK基因片段,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,BamHI和XhoI双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白抗原,SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA测定多抗滴度,Western blotting鉴定免疫活性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出1 092bp的AK目标基因片段,并构建原核表达载体,诱导含pET28a/AK的宿主菌获得了高浓度、与预期分子量大小相符的表达产物,经Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rAK蛋白,Western blotting显示rAK能够被TORCH试剂盒中的Tox-IgG阳性控制血清识别,获得了纯化的重组蛋白。rAK蛋白免疫新西兰白兔,获得滴度为1∶106多价抗血清。结论成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了AK基因,构建了pET28a/AK重组质粒,并获得了高效表达,免疫新西兰白兔获得了高效价多克隆抗体,为弓形虫iRNA及弓形虫病的免疫诊断奠定了基础。

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。

刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建

目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白11(ROP11)的真核表达重组质粒并在真核细胞中表达目的蛋白。方法设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RT-PCR方法扩增ROP11基因并克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1-ROP11。将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 RT-PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1 548bp,与预期大小相符。构建的重组质粒pcDNA3.1-ROP11经PCR及EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确。重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核苷酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99%。免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。

霍乱毒素联合弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的GALT和NALT黏膜免疫应答

目的观察霍乱毒素（CT）联合弓形虫排泄-分泌抗原（ESA）鼻内免疫小鼠诱导的肠相关淋巴组织（GALT）和鼻相关淋巴组织（NALT）黏膜部位的免疫应答。方法将48只5～6周龄BABL／c小鼠随机均分为3组，分别用PBS、ESA和CT＋ESA滴鼻免疫小鼠2次，间隔2周。末次免疫后14d，处死小鼠，ELISA测定小鼠粪便和鼻咽冲洗液sIgA抗体水平；计数派伊尔淋巴集结（PP）、肠上皮淋巴细胞（IEL）、NALT和鼻通道（NC）淋巴细胞数，免疫细胞化学法检测CD4^＋、CD8^＋T细胞亚群水平。结果免疫后14d，CT＋ESA组小鼠鼻咽冲洗液和粪便sIgA水平显著高于ESA组和PBS组（P〈0．01）；CT＋ESA和ESA组小鼠GALT部位的PP淋巴细胞显著增生，主要以CD4^＋T细胞为主；而IEL以CD8^＋T细胞增生为主，CD4^＋／CD8^＋比值降低（P〈0．05）。CT＋ESA NALT内淋巴细胞明显增生。CT＋ESA组NC淋巴细胞显著升高（P〈0．01），以CD4^＋T细胞增生为主。结论CT佐剂联合ESA滴鼻免疫BALB／c小鼠可诱导GALT和NALT黏膜部位免疫应答。