代谢工程强化tolC缺失大肠杆菌的血红素合成

血红素作为生物体可利用的铁源应用于食品和医疗领域。利用微生物发酵生产血红素具有工业前景但产量偏低,该研究利用代谢工程改造大肠杆菌,提高菌体血红素合成水平。通过构建tolC缺失大肠杆菌,进而过表达hemA、hemH,外源添加Fe^(2+)的方式实现血红素产量的提升。结果表明,在tolC缺失菌株WTΔT中过表达hemA导致卟啉的积累;在外源添加80μmol/L的Fe^(2+)时,共表达hemA与hemH的菌株WTΔT-AH,胞内血红素含量达到40.18μmol/L,是野生菌WT的3.98倍。该研究为使用重组大肠杆菌高效生产血红素提供了一定的理论依据和潜在的应用价值。

大肠埃希菌AcrAB-TolC外排泵表达水平调控机制的研究进展

AcrAB-TolC外排泵的过量表达是引起大肠埃希菌多重耐药的主要原因。AcrAB-TolC外排泵的表达水平主要受其正向调节因子、负向调节因子以及环境中的化学物质等调节。本文综述了近年来AcrAB-TolC外排泵调控因子方面的研究进展。

志贺菌主动外排泵acrAB-tolC及调控基因marOR突变与耐药的关系

目的:研究志贺菌的耐药状况,检测临床分离志贺菌主动外排泵acrAB-tolC基因及调控基因marOR的突变情况,并探讨其与耐药性的关系。方法:对159株临床分离的志贺菌进行四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、诺氟沙星、复方新诺明6种药物的药敏试验和有机溶剂耐受试验,对其acrAB-tolC基因和marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增,并进行限制性内切酶酶切与单链构象多态性(SSCP)分析。结果:159株临床分离的志贺菌属细菌筛选出4株敏感株、18株耐单药株和137株耐多药株,耐多药率为86.2%(137/159);159株中有122株对有机溶剂耐受,耐受率为76.7%(122/159);159株均扩增出acrAB-tolC基因和marOR基因,未发现基因缺失株;单链构象多态性分析,155株耐药菌株中,marOR基因的突变率为17.4%,acrA基因的突变率为5.8%,acrB基因的突变率为3.9%,tolC基因的突变率为2.6%;4株敏感株未发现marOR、acrA、acrB和tolC基因突变。结论:临床分离的志贺菌耐多药率和有机溶剂耐受率均较高,且存在较高的marOR基因突变率。

以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析

目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体。方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体。利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构。结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析。一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致。二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础。根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高。结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础。

TolC表达量与大肠埃希菌K-12耐四环素的研究

随着抗生素的开发与使用,细菌在对多种抗生素的适应过程中逐渐发展出对抗生素耐药的反应机制。TolC是药物排出转运体系的外膜成分,与AcrAB一起形成主要的药物排出泵,有关其表达量与耐药间的关系目前尚不清楚。试验将tolC克隆到pET-32a载体上进行诱导表达,镍柱纯化,免疫新西兰大白兔,获得1:4000的抗血清。Western blotting分析表明,TolC的表达量在耐四环素的大肠埃希菌K-12中比对照组提高50%。细菌TolC高表达试验发现,其MIC从100μg/ml提高到200μg/ml。结果说明TolC的表达量与四环素耐药性直接相关,提示细菌可以通过调节外膜蛋白的表达实现对抗生素的耐受。

大肠杆菌的AcrAB-TolC多药外排泵及其调控研究进展

多药外排泵造成了细菌的多种药物的耐药现象,这对感染性疾病的防治提出了挑战。对于多药外排泵的研究不仅使人们认识细菌耐药性机制,而且为细菌耐药性的防治提供思路。大肠杆菌AcrAB-TolC外排泵系统的结构和调控机制研究取得了一些新进展,这为病原菌的相关研究提供了参考,本文对其进行了综述。

细菌AcrAB-TolC型外排泵中AcrA蛋白的进化分析

研究不同耐药细菌AcrAB-Tolc型外排泵中关键蛋白AcrA的序列,针对其保守及非保守氨基酸残基进行该类蛋白的进化分析,构建蛋白进化树。收集来源于不同细菌的已知序列的AcrA蛋白,去除冗余并进行序列比对之后,根据其序列比对结果的相似性、氨基酸残基的保守性研究其进化特征。结果表明,不同细菌的AcrA蛋白部分氨基酸残基具有高度的保守性,这与其实现生物学功能有关,非保守区域是主要的进化区域。可为不同菌株的进化提供参考,同时为以AcrAB-Tolc型外排泵为靶标的新药研究提供相关数据。

AcrAB-TolC电泵系统介导的鼠伤寒沙门菌多重耐药机理研究

目的探讨AcrAB-TolC电泵系统在鼠伤寒沙门菌产生多重耐药中的作用。方法利用基因敲除技术,敲除多重耐药鼠伤寒沙门菌野生株X2的acrAB基因和tolC基因,获得两个突变株△tolCX2和△acrABX2。通过基因敲除前后细菌耐药水平的改变,验证AcrAB-TolC系统在鼠伤寒沙门菌产生多重耐药中的作用。结果△tolCX2和△acrABX2对万古霉素耐药,对丁胺卡那霉素、头孢曲松敏感,与野生株X2一致;但对11种抗生素由耐药变为敏感。结论AcrAB-TolC系统与鼠伤寒沙门菌多重耐药的产生有关。

阴沟肠杆菌AcrAB-TolC外排系统基因的相关性研究

目的了解阴沟肠杆菌AcrAB-TolC外排系统基因的携带情况,探讨其与阴沟肠杆菌对常用抗菌药物耐药之间的关系。方法采用法国梅里埃Vitek 2 compact仪对临床分离的136株阴沟肠杆菌进行鉴定和药敏;采用PCR法检测AcrABTolC外排系统acr A,acr B,acr R和tol C四种基因在阴沟肠杆菌中的分布情况,并根据检测结果进行耐药率分组比较。结果136株阴沟肠杆菌对头孢曲松的耐药率达52.2%,对亚胺培南的耐药率高达15.4%;AcrAB-TolC外排系统tol C基因的检出率最高(95.6%),其次为acr R基因(80.9%),acr A基因的检出稍低(70.6%),acr B基因的检出率最低(61.7%)。同时携带四种基因的菌株最多,占36.8%;各外排系统基因阳性组的耐药率均高于阴性组。结论阴沟肠杆菌耐药问题较严峻,AcrAB-TolC外排系统acr A,acr B,acr R和tol C四种基因在阴沟肠杆菌中普遍且存在差异性,并在多药耐药形成中发挥了重要作用。

迟缓爱德华菌FliC-TolC融合蛋白表达及免疫特性研究

鞭毛蛋白FliC与外膜蛋白TolC均具有免疫保护效果,其中FliC蛋白具有疫苗佐剂的特性,但目前尚未有关迟缓爱德华菌(E.tarda)FliC-TolC融合产物免疫动物的免疫效果的相关报道。为研究E.tarda FliC-TolC融合蛋白的免疫特性,本研究利用融合PCR方法扩增获得fliC-tolC片段,构建重组载体pET-28a-fliC-tolC,并利用E.coli BL21表达系统表达了融合蛋白FliC-TolC。将纯化的FliC-TolC、TolC、FliC蛋白免疫小鼠后,以E.tarda强毒株攻毒评估免疫效果;并利用斑马鱼模型进行了平行试验。结果显示,本研究克隆了E.tarda fliC-tolC基因并表达和纯化了相应重组蛋白FliC-TolC;FliC-TolC蛋白激发小鼠产生的抗体水平优于FliC、TolC蛋白单独免疫组,表明FliC-TolC蛋白具有优良的免疫原性。攻毒试验表明FliC-TolC蛋白组小鼠对强毒株可产生较好的抵抗力,相对保护率为95%;斑马鱼攻毒试验相对保护率为60%。本研究证实了E.tarda重组蛋白FliC-TolC的免疫效力,为进一步研制E.tarda亚单位疫苗提供了参考和借鉴。

AcrAB-TolC外排泵在多重耐药肠杆菌中的作用研究进展

耐多药肠杆菌的出现严重威胁着人类健康。AcrAB-TolC外排泵的过量表达是引起肠杆菌多重耐药的主要机制之一,其主要由周质融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和药物质子转运子AcrB构成,受整体调控因子、局部调控因子以及环境中的化学物质等调节。对AcrAB-TolC外排泵的研究,不仅有助于阐明相关耐药本质,还有助于研制有临床意义的外排泵抑制剂(EPIs),为解决肠杆菌多重耐药问题提供新思路。本文对AcrAB-TolC外排泵的结构、调控等方面的研究进展作一综述。

志贺菌属外排泵AcrAB-TolC及其调控基因突变与氟喹诺酮耐药性的关系

目的探讨临床分离耐氟喹诺酮志贺菌外排泵Acr AB-Tol C基因及其调控基因mar OR、acr R、sox S突变与耐药性的关系。方法使用K-B纸片扩散法筛选临床耐药菌,测定加入泵抑制剂羰基氢氯苯腙(CCCP)后萘啶酸、左氧氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)的变化,PCR扩增外排泵基因acr A、acr B及其调控基因mar OR、acr R、sox S并测序。结果 159株志贺菌中共筛选出11株氟喹诺酮耐药菌株;加入质子泵抑制剂后2株耐药菌株对氟喹诺酮类抗菌药的MIC下降;7株耐药菌对氟喹诺酮类抗菌药的MIC不变;2株耐药菌对氟喹诺酮类抗菌药的MIC上升。基因测序发现氟喹诺酮耐药菌株外排泵Acr AB-Tol C调控基因mar OR第36、37、38、39位存在CATT碱基缺失。结论泵抑制剂可部分抑制外排泵的活性。mar OR突变可能与志贺菌对氟喹诺酮类抗菌药耐药有关。

鼠伤寒沙门菌cpxR和tolC双基因缺失株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

为了探索CpxAR和AcrAB-tolC的协同作用对鼠伤寒沙门菌多重耐药性的调控机制,利用噬菌体转导技术,以前期构建的鼠伤寒沙门菌(JS)的tolC缺失株JSΔtolC::kan为供体菌,以cpxR缺失株JSΔcpxR为受体菌,在P22噬菌体的作用下成功构建了JS的双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC::kan;再利用pCP20质粒消除卡那抗性基因kan,获得了JSΔcpxRΔtolC,并构建了cpxR回补株JSΔcpxRΔtolC/p cpxR。采用微量肉汤稀释法测定了12种常用抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示:tolC缺失株对环丙沙星、头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、头孢噻呋、氟苯尼考、土霉素、恩诺沙星、阿米卡星的MIC值分别降低至JS的1/8、1/2、1/4、1/8、1/8、1/2、1/16、1/4、1/4、1/8、1/2;cpxR和tolC双基因缺失株对头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、恩诺沙星的MIC均又进一步降低至tolC缺失株的1/2;而将cpxR基因回补到双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC中后,对环丙沙星、头孢噻肟、头孢噻呋的MIC值均升高了2倍,对恩诺沙星的MIC升高至4倍,对头孢喹肟的MIC升高了8倍。说明cpxR缺失与tolC缺失的协同作用能增强鼠伤寒沙门菌对头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、恩诺沙星的敏感性。

鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白TolC的原核表达及抗原性分析

探究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白TolC的免疫原性与抗原性,评价其免疫学功能,以期为嗜水气单胞菌亚单位疫苗的开发提供理论依据。采用生物信息学方法预测TolC蛋白的理化性质,分析其菌属间同源性与进化关系,构建TolC蛋白表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化TolC蛋白,免疫小鼠制备TolC抗血清,Western blot检测抗血清特异性与效价,免疫酶联法模拟TolC蛋白抗血清对不同鱼类致病菌的体外识别,探究TolC蛋白的抗原性。结果表明,TolC蛋白为孔道蛋白,在气单胞菌属间进化保守。成功表达、纯化了TolC蛋白,其最佳表达条件:菌液OD 600为1.0、IPTG浓度0.1 mmol/L、37℃诱导8 h。Western blot结果表明,制备获得特异性TolC抗血清,效价达到1∶3200;ELISA结果显示,TolC抗血清与嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、溶藻弧菌均存在识别作用。综上,嗜水气单胞菌外膜蛋白TolC具有较好的免疫原性和抗原性,并可能对不同鱼类致病菌存在交叉免疫保护作用。

细菌排出泵、TolC家族和生物薄膜的作用机制研究进展

在多种重要病原体中存在抗生素排出泵,它与其它抗性一起构成了细菌显著的耐药性,其识别的底物非常广泛。G-菌中还存在与排出泵不同的另一种以蛋白质构成的排出系统,通过底物特异性内膜蛋白和外膜蛋白TolC家族的可逆性互作,也可以直接将包括小分子药物和大分子蛋白毒素等的多种分子从胞浆经周质区运到体外。粘附在内置医疗装置或组织中的细菌因其形成生物薄膜结构和以蛋白质、多糖为主的水性基质包裹的菌体也可以产生长期感染以及对抗生素的持久抗性,这种抗性与经典的质粒、转座子或突变产生的抗性不同。本文对细菌TolC家族和生物薄膜引起的抗性机制进行了综述。

维氏气单胞菌TolC蛋白的生物信息学分析

目的利用生物信息学技术预测和分析维氏气单胞菌TolC蛋白的生物学特性、结构、功能及进化关系,为研究其致病机制以及开发新的疫苗和新的药物靶点提供参考。方法从NCBI蛋白质数据库中获取TolC序列,使用ProtParam、ProtScale、SignalP5.0、TMHMM2.0、PSORTb、NetPhos3.1、CD-search、SPOMA、SWISS-MODEL、ABCpred、IEDB等生物信息学工具分析和预测TolC蛋白的理化性质、亲疏水性、跨膜区域、信号肽、保守结构域、亚细胞定位、磷酸化位点、二级和三级结构、B细胞抗原表位和互作蛋白。利用MEGA5.2构建系统进化树,分析不同细菌间TolC蛋白的进化关系。结果TolC蛋白由439个氨基酸组成,分子式为C_(2112)H_(3414)N_(600)O_(689)S_(5),是稳定的亲水性蛋白。该蛋白亚细胞定位于细胞外,无跨膜结构域,有信号肽SP(Sec/SPI),含有52个磷酸化位点和多个B细胞抗原表位。蛋白的主要二级结构为α-螺旋,三级结构为同源三聚体。TolC蛋白具有外膜通道蛋白的保守结构域,与B565_1337、macB等多药外排泵相关蛋白有互作关系。进化分析显示维氏气单胞菌TolC蛋白与嗜水气单胞菌TolC蛋白遗传进化关系最近。结论维氏气单胞菌TolC蛋白作为多药外排泵的外膜通道蛋白,与细菌致病和耐药性密切相关。该蛋白具有多个B细胞抗原表位,是潜在的药物靶点和疫苗候选蛋白。

主动外排系统AcrAB-TolC与肺炎克雷伯菌耐药性关系研究

目的探讨主动外排系统AcrAB-TolC与肺炎克雷伯菌耐药性的关系。方法运用琼脂稀释法检测抗生素和消毒剂对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度;PCR扩增肺炎克雷伯菌acrA、acrB和toiC基因,分析AcrAB-TolC与肺炎克雷伯菌耐药的关系。结果肺炎克雷伯菌82.55%检出acrA基因,85.37%检出acrB基因,81.60%检出toiC基因,三基因均阳性,三基因均阴性、部分基因阳性分别占71.22%、9.91%和18.87%;AcrAB-TolC阳性组对阿奇霉素、四环素、氯霉素、苯扎溴胺(1︰49)、碘伏(1︰4)、消佳净(1︰49)的耐药率与AcrAB-TolC缺陷组、AcrAB-TolC阴性组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论肺炎克雷伯菌对阿奇霉素、四环素、氯霉素及中间工作浓度的消毒剂产生耐药性与携带主动外排系统AcrAB-TolC关系密切。

迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC原核表达及其免疫原性

TolC是革兰阴性细菌一种外膜通道蛋白,参与细菌应对外界不利环境的耐受,沙门菌TolC蛋白作为免疫原对动物沙门菌感染的保护效果优良,具有潜在的应用价值。目前,迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)该蛋白的研究尚未见有报道,本研究以E.tarda TolC蛋白作为研究对象,原核表达并纯化TolC蛋白,进一步通过动物试验确定该蛋白具有较强的免疫原性,免疫动物对致病性E.tarda ET-13强毒株感染具有较高的抵抗力。结果表明,E.tarda TolC蛋白具有较强的免疫原性和潜在的疫苗价值,为进一步研制E.tarda亚单位疫苗提供理论资料。

苦豆子碱对耐多药大肠杆菌AcrAB-ToLC蛋白表达量影响

本文通过微量肉汤稀释法筛选出了2株耐环丙沙星(CIP)、头孢噻肟(CTX)、阿米卡星(AN)、氨苄西林(AM)药物的多重耐药性大肠杆菌,测定了苦豆子碱对大肠埃希菌多重耐药菌株的MIC值为12.5mg/mL,MH肉汤稀释棋盘式法测定环丙沙星联合苦豆子碱、CCCP MIC值,通过计算部分抑菌浓度指数判断环丙沙星联合苦豆子碱呈协同作用,优化试验确定最适宜的逆转条件对耐药性大肠埃希菌进行逆转,对编码外排泵系统中AcrA、AcrB、AcrR、ToLC蛋白基因进行克隆、测序,同时应用实时定量PCR检测苦豆子碱对多重耐药菌株作用前后AcrA、AcrB、AcrR、ToLC蛋白的mRNA表达量影响。数据分析发现作用前后编码大肠杆菌外排泵系统AcrA、AcrB、AcrR、ToLC蛋白基因碱基序列未发生变化,但苦豆子碱作用后外排泵系统中AcrA、AcrB蛋白mRNA表达量下降,负调控蛋白AcrR mRNA表达量上升。苦豆子碱从整体上可以抑制耐多药大肠埃希氏菌AcrAB-ToLC的蛋白mRNA表达量,使大肠杆菌多药外排泵AcrAB-ToLC的蛋白mRNA表达量下降,从而恢复大肠杆菌对抗生素的相对敏感性。实验结果为深入研究苦豆子碱逆转耐药性大肠杆菌其它机制提供了依据和参考.