Toll作用蛋白C2结构域的纯化和结构研究

在大肠杆菌中高表达了谷胱甘肽S转移酶(GST)-Toll作用蛋白C2结构域融合蛋白,并通过GST磁珠纯化融合蛋白,用凝血酶把GST和C2结构域切开,采用尺寸排阻色谱纯化了C2结构域.用圆二色谱和核磁共振波谱法研究了C2结构域在三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液中的结构,结果表明C2结构域在缓冲液中形成了以β折叠为主的结构.

Tollip蛋白在免疫相关性疾病的研究进展

Toll作用蛋白(Toll-interacting protein,Tollip)是一种接头蛋白,可在Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)信号通路中起负反馈调节作用,以Toll样受体4(Tolllikereceptor4,TLR4)最为关键,参与其免疫相关性疾病的发生过程。尽管Tollip在免疫相关性疾病的研究仍处于早期阶段,但其在免疫相关性疾病的预防、诊断、治疗及预后判断方面的研究已获得一定的成果。因此,本文就近些年在免疫相关性疾病中的Tollip研究进展作一综述。

脊柱结核患者外周血TLR4、IL-17、Tollip mRNA水平及临床意义

目的 探究脊柱结核患者外周血Toll样受体4(TLR4)、白细胞介素-17(IL-17)及Toll作用蛋白(Tollip) mRNA的表达意义。方法 选择2020年1—12月收治的脊柱结核96例作为观察组,选择同期进行体检的健康者40例作为对照组。检测2组受试者外周血中TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平,使用受试者工作特征(ROC)曲线分析外周血中TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达对脊柱结核的诊断效能。观察组均随访1年,根据是否复发分为未复发组68例及复发组28例,观察2组外周血中TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达情况,分析其表达对脊柱结核复发的预测效能。结果 观察组外周血中TLR4、IL-17及Tollip mRNA水平均高于对照组(P<0.01);ROC曲线分析显示,外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平对脊柱结核患者的诊断效能均较高(P<0.05)。复发组外周血中TLR4、IL-17、Tollip mRNA水平均高于未复发组(P<0.01);ROC曲线分析显示,外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平对脊柱结核患者复发的预测效能均较高(P<0.05)。结论 外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平可用于诊断脊柱结核,且对预测患者是否复发有一定价值。

日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白 基因的克隆 表达及鉴定

目的克隆、表达日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白(SjTollip)基因,并研究该基因在日本血吸虫各虫期的转录表达情况。方法从日本血吸虫cDNA文库中挑出Toll样受体相互作用蛋白基因进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA和重组SjTollip蛋白免疫新西兰白兔的免疫兔血清,利用RT-PCR和蛋白质免疫印迹分析SjTollip基因在日本血吸虫各期转录表达的差异及重组SjTollip蛋白的免疫原性。结果构建了重组原核表达载体SjTollip/pET-28a,诱导获得以包涵体形式表达的不可溶重组蛋白,相对分子质量约为24000,与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白rSjTollip可被日本血吸虫感染兔血清识别。虫期转录特异性分析显示,该基因在尾蚴和雄虫中转录水平较低。免疫印迹分析结果显示,在虫卵、尾蚴、童虫、雄虫、雌虫各发育阶段都检测到该蛋白,但童虫和雌虫中表达水平明显升高。结论 SjTollip基因在日本血吸虫各发育阶段转录表达水平有较大差异,其有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。

栀子苷抑制TLR4/RIP3/NF-κB信号通路对急性胰腺炎大鼠肠损伤的影响

目的研究栀子苷抑制Toll样受体4(TLR4)/受体相互作用蛋白3(RIP3)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路对急性胰腺炎(AP)大鼠肠损伤的影响。方法以胰管逆行注射牛磺胆酸钠溶液的方法建立AP大鼠模型,随机分为模型组、栀子苷低剂量(40 mg/kg)组、栀子苷高剂量(80 mg/kg)组、栀子苷(80 mg/kg)+脂多糖(LPS,TLR4激活剂,0.4 mg/kg)组4组(每组12只),另取12只大鼠开腹后仅翻转胰腺,不做其他处理,设为假手术组。以栀子苷、LPS分组对大鼠进行干预处理后,检测大鼠疾病活动指数(DAI)和结肠大体形态损伤评分;检测大鼠肠道通透性,比较荧光素异硫氰酸酯(FITC)葡聚糖浓度;HE染色检测大鼠结肠黏膜组织病理损伤,并进行Chiu评分;酶标仪检测大鼠血清D-乳酸、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、二胺氧化酶(DAO)、白细胞介素(IL)-17、IL-1β与IL-6水平;蛋白免疫印迹实验检测大鼠肠黏膜组织TLR4/RIP3/NF-κB信号通路相关蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠肠黏膜组织出现病理损伤严重,DAI、结肠大体形态损伤评分、Chiu评分、FITC葡聚糖浓度、血清D-乳酸、ICAM-1、DAO、IL-17、IL-1β与IL-6水平、肠黏膜组织p-NF-κB p65/NF-κB p65及TLR4、RIP3蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,栀子苷低、高剂量组大鼠肠黏膜组织出现病理损伤均减轻,DAI、结肠大体形态损伤评分、Chiu评分、FITC葡聚糖浓度、血清D-乳酸、ICAM-1、DAO、IL-17、IL-1β与IL-6水平、肠黏膜组织p-NF-κB p65/NF-κB p65及TLR4、RIP3蛋白表达水平均降低(P<0.05),高剂量栀子苷对以上指标的改善效果更明显;与栀子苷高剂量组相比,栀子苷+LPS组大鼠肠黏膜组织出现病理损伤加重,DAI、结肠大体形态损伤评分、Chiu评分、FITC葡聚糖浓度、血清D-乳酸、ICAM-1、DAO、IL-17、IL-1β与IL-6水平、肠黏膜组织p-NF-κB p65/NF-κB p65及TLR4、RIP3蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论栀子苷可通过抑制TLR4/RIP3/NF-κB信号而减轻AP大鼠体内炎症,缓解大鼠结肠黏膜病理损伤,修复肠道屏障功能。

双歧杆菌对新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型的保护作用

目的探讨双歧杆菌对新生大鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)模型的保护作用及分子机制。方法将45只新生大鼠随机分为对照组(n=14)、NEC组(n=16)和干预组(n=15)。对照组由哺乳期母鼠代乳,NEC组和干预组给予连续3天人工喂养和每天2次缺氧+寒冷刺激,干预组额外给予每天2次青春型双歧杆菌(每次1×108CFU)。比较3组肠道病理评分、NEC发生率,采用荧光定量PCR方法检测Toll样受体4(TLR4)、Toll作用蛋白(TOLLIP)及单Ig区IL-1相关受体(SIGIRR)mRNA表达并进行组间比较。结果对照组、NEC组和干预组肠道病理评分分别为0分、(2.4±1.0)分和(1.3±0.6)分;NEC发生率分别为0(0/14)、77.8%(7/9)和23.1%(3/13);TLR4 mRNA相对表达量分别为1.00±0.38、3.64±1.73和1.78±0.70;TOLLIP mRNA相对表达量分别为1.00±0.85、0.23±0.15和0.86±0.62;SIGIRR mRNA相对表达量分别为1.00±0.58、0.27±0.12和0.71±0.49。干预组与NEC组肠道病理评分和NEC发生率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。NEC组TLR4 mRNA表达高于对照组和干预组,TOLLIP mRNA、SIGIRR mRNA表达低于对照组和干预组(P<0.05);干预组与对照组TLR4、TOLLIP和SIGIRR mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论双歧杆菌对新生大鼠NEC模型肠道起保护作用,可能通过下调肠道组织TLR4 mRNA表达及上调TOLLIP和SIGIRR mRNA表达发挥作用。

Toll样受体4及其负调控因子在大鼠不同发育阶段肠组织表达的比较

目的:通过比较Toll样受体4(TLR4)及其负调控因子单Ig区IL-1相关受体(SIGIRR)和Toll作用蛋白(Tollip)在SD大鼠不同发育阶段肠段组织的表达,进一步了解新生儿坏死性小肠结肠炎的发病机制。方法:将孕20 d胎鼠剖腹产获得早产新生大鼠6只纳入早产组,顺产第1天新生大鼠6只纳入足月组,生后6周SD大鼠作为成年组。处死3组大鼠并解剖腹部,获得回肠末端肠道组织。通过荧光定量PCR的方法检测3组大鼠回肠末段组织的TLR4、SIGIRR、Tollip基因mRNA相对表达量,分别比较3个基因在3组SD大鼠肠组织中表达量。结果:早产组TLR4 mRNA的表达量是足月组的2.36倍,而成年组则是足月组的1/4,差异均有统计学意义(P<0.05)。早产组SIGIRR mRNA的表达量是足月组的1/7,而成年组则是足月组的1.37倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。早产组Tollip mRNA的表达量是足月组1/20,两组的差异有统计学意义(P<0.05),成年组的Tollip mRNA表达量未得到结果。结论:不成熟的肠道组织TLR4表达量多,TLR4负调控因子SIGIRR、Tollip表达下调。