苦豆碱通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路改善香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤

目的探究苦豆碱(Alo)对香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤的作用及其可能的作用机制。方法16HBE人支气管上皮细胞经100 mL/L香烟烟雾提取物(CSE)和(50、100、200)μmol/L Alo共处理后,CCK-8法检测细胞活力,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)活性;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)、Western blot法检测细胞凋亡,ELISA检测炎性因子水平;2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针和相关试剂盒检测氧化应激水平;Western blot法检测Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)/含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)通路相关蛋白表达水平。16HBE细胞经100 mL/L CSE和200μmol/L Alo共处理后,采用上述方法检测过表达TLR4对TLR4/NF-κB/NLRP3通路、细胞LDH活性、凋亡、炎症反应及氧化应激的影响。结果CSE暴露可降低16HBE细胞活力,增加LDH释放和细胞凋亡,增强炎症反应和氧化应激水平,且激活TLR4/NF-κB/NLRP3通路;经Alo处理后,细胞活性升高,LDH释放减少、凋亡降低、炎症减轻、氧化应激水平下降,且TLR4/NF-κB/NLRP3通路失活;TLR4过表达可逆转Alo处理对CSE诱导的16HBE细胞损伤的保护作用。结论Alo可通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路减轻CSE诱导的人支气管上皮细胞损伤。

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨积雪草酸对急性肺损伤大鼠氧化应激和NLRP3炎症小体的影响

目的 观察积雪草酸对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤大鼠氧化应激和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体相关蛋白的影响,并探讨其相关分子机制。方法 将60只SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组、积雪草酸低剂量组、积雪草酸高剂量组和地塞米松组,每组12只。除对照组外,其余组大鼠均采用LPS气管滴注法建立急性肺损伤模型。模型建立成功后第2天,积雪草酸低、高剂量组大鼠分别腹腔注射25 mg/kg和75 mg/kg积雪草酸溶液,地塞米松组大鼠腹腔注射2 mg/kg地塞米松注射液,对照组和模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水,均1次/d,连续注射8周。HE染色观察大鼠肺组织病理形态,称重法计算肺组织湿/干重比值,TUNEL染色检测大鼠肺组织细胞凋亡情况,试剂盒检测大鼠支气管肺泡灌洗液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量,Western blot法检测肺组织中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Toll样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白88(MyD88)、核转录因子-κB(NF-κB)和磷酸化NF-κB(p-NF-κB)表达情况。结果 与对照组比较,模型组大鼠肺组织可见明显病理损伤,肺组织湿/干重比值、细胞凋亡率、支气管肺泡灌洗液中MDA含量和肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、TLR4、MyD88蛋白相对表达量及p-NF-κB/NF-κB比值均显著升高(P均<0.05),支气管肺泡灌洗液中SOD、GSH-Px含量均显著降低(P均<0.05)。与模型组比较,积雪草酸低、高剂量组和地塞米松组大鼠肺组织病理损伤显著改善,肺组织湿/干重比值、细胞凋亡率、支气管肺泡灌洗液中MDA含量和肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、TLR4、MyD88蛋白相对表达量及p-NF-κB/NF-κB比值均显著降低(P均<0.05),支气管肺泡灌洗液中SOD、GSH-Px含量均显著升高(P均<0.05),且积雪草酸高剂量组和地塞米松组大鼠上述指标变化均显著优于积雪草酸低剂量组(P均<0.05)。结论 积雪草酸可通过抑制氧化应激和NLRP3炎症小体激活减轻LPS诱导的急性肺损伤,其作用机制可能与调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路探讨补阳还五汤调控巨噬细胞极化的作用机制

目的:基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)通路探讨补阳还五汤调控巨噬细胞极化的作用机制。方法:本实验通过采用不同浓度(0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 mg·L^(-1))脂多糖(LPS)对RAW264.7巨噬细胞干预24 h,细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测RAW264.7巨噬细胞存活率,筛选最适浓度建立体外LPS诱导RAW246.7巨噬细胞炎症模型。将实验分为空白组(20%空白血清),模型组(20%空白血清+10 mg·L^(-1)LPS),模型对照组(20%FBS+10mg·L^(-1)LPS),低、中、高(5%、10%、20%)补阳还五汤含药血清组及NLRP3抑制剂MCC950(50μmol·L^(-1))、活性氧(ROS)抑制剂NAC(10μmol·L^(-1))、NF-κB抑制剂PDTC(10μmol·L^(-1))联合补阳还五汤高剂量(20%)组。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测RAW264.7巨噬细胞白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达情况;流式细胞术检测巨噬细胞ROS水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测M1型巨噬细胞相关细胞因子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、M2型巨噬细胞相关细胞因子精氨酸酶1(Arg-1)、白细胞介素-10(IL-10)蛋白表达,TLR4/NF-κB/NLRP3通路的相关蛋白表达。结果:CCK-8结果显示,在10 mg·L^(-1)LPS的刺激下,RAW264.7巨噬细胞的细胞活力值最高(P<0.01)。与空白组比较,模型组IL-1β、IL-18、TNF-α水平显著升高(P<0.01);ROS表达量显著上升(P<0.01);M1型巨噬细胞iNOS、TNF-α蛋白表达显著升高(P<0.01),M2型巨噬细胞Arg-1、IL-10蛋白表达显著降低(P<0.01);TLR4、髓样分化因子88(Myd88)、磷酸化核转录因子-κB抑制蛋白(p-IκB)/核转录因子-κB抑制蛋白(IκB)、磷酸化核转录因子-κB(p-NF-κB)p65/NF-κB p65、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1前体(pro-Caspase-1)蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,补阳还五汤各给药组及抑制剂组均可明显降低IL-1β、IL-18、TNF-α水平(P<0.05,P<0.01),抑制RWA264.7巨噬细胞炎症因子的表达;降低细胞ROS表达水平(P<0.01);下调M1型巨噬细胞iNOS、TNF-α蛋白(P<0.01),上调M2型巨噬细胞Arg-1、IL-10蛋白表达(P<0.05,P<0.01);降低TLR4、Myd88、p-IκB/IκB、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:补阳还五汤可改善巨噬细胞炎症反应,可能与降低巨噬细胞ROS水平,抑制RAW264.7巨噬细胞极化,下调TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白表达水平有关。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨脉络舒通丸保护小鼠脑缺血再灌注损伤的作用机制

目的:探讨脉络舒通丸对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法:60只雄性ICR小鼠按体质量随机分为假手术对照组、模型对照组、尼莫地平0.024g/kg组和脉络舒通丸1.8、3.6、7.2 g/kg组,每组10只。各组灌胃给予相应药物或水预处理7 d,采用线栓法制备小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。再灌注24 h后评估各组小鼠神经功能评分、脑含水量及脑梗死体积占比;HE染色观察缺血核心区脑组织病理学改变;ELISA法检测脑组织匀浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6含量;免疫印迹法分析小鼠缺血脑组织与半暗带组织中TLR4、p-NF-κB p65、NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、cleaved IL-1β蛋白表达。结果:与假手术对照组相比,模型对照组小鼠神经功能评分、脑含水量、脑梗死体积占比明显升高(P<0.05或P<0.01),HE染色显示脑组织产生损伤性病理改变,脑组织TNF-α、IL-1β及IL-6的含量均显著升高(P<0.01),缺血脑组织与半暗带组织中TLR4、p-NF-κB p65、NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、cleaved IL-1β蛋白表达均显著上调(P<0.01);与模型对照组相比,脉络舒通丸3.6、7.2 g/kg组神经功能评分、脑含水量、脑梗死体积占比明显减少(P<0.05或P<0.01);脉络舒通丸各组小鼠脑组织病理学均有显著改善,脑组织TNF-α、IL-1β及IL-6的含量明显降低(P<0.05或P<0.01);脉络舒通丸7.2 g/kg组小鼠缺血脑组织与半暗带组织中TLR4、p-NF-κB p65、NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、cleaved IL-1β蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论:脉络舒通丸可通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,抑制神经炎症反应,从而达到对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。