基于TLR4/PI3K/Akt/NF-κB信号通路探讨热毒宁注射液抑制脂多糖刺激的BEAS-2B细胞炎症因子表达的作用机制

目的:基于Toll样受体4(TLR4)/磷脂肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路探究热毒宁注射液(RDN)对脂多糖(LPS)刺激的人支气管上皮细胞BEAS-2B炎症因子表达的影响及机制。方法:采用高效液相色谱法(HPLC)测定RDN冻干粉中栀子苷和绿原酸含量;采用分子对接技术评估栀子苷和绿原酸与TLR4的结合能力。通过体外实验构建LPS(1μg·mL^(–1))刺激的BEAS-2B细胞气道炎症模型;采用噻唑蓝(MTT)法检测LPS诱导的BEAS-2B细胞活力;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测LPS诱导的BEAS-2B细胞炎症因子mRNA的表达;通过免疫印迹法(WB)检测LPS诱导的BEAS-2B细胞TLR4/PI3K/Akt/NF-κB信号通路相关蛋白质的表达;采用免疫荧光法(IF)检测转录因子c-Jun和p65的入核情况。结果:RDN冻干粉中栀子苷和绿原酸的质量分数分别为127.00、70.26 mg·g^(–1);栀子苷和绿原酸均能与TLR4结合,结合能分别为–7.0、–7.9 kcal·mol^(–1)。质量浓度为12.5~400.0μg·mL^(–1)时,RDN对LPS刺激的BEAS-2B细胞活力无显著的抑制作用;质量浓度为200.0~400.0μg·mL^(–1)时,RDN能明显下调白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、趋化因子CXC配体2(CXCL2)、CXCL5、趋化因子配体5(CCL5)、CCL20 mRNA的表达。此外,RDN能降低TLR4/PI3K/Akt/NF-κB信号通路相关蛋白质PI3K、Akt、TANK结合激酶1(TBK1)、IκB激酶(IKK)α/β、NF-κB抑制因子α(IκBα)、p65、p38、c-Jun N-末端激酶(JNK)、胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun的磷酸化水平,同时抑制LPS激活的BEAS-2B细胞p65和c-Jun的入核。结论:RDN能下调LPS诱导的BEAS-2B细胞炎症因子mRNA的表达,其机制与RDN阻断TLR4/PI3K/Akt/NF-κB信号通路有关。

GRB2基因沉默介导PI3K/AKT/NF-κB信号通路对动脉粥样硬化大鼠脂质沉积和炎性浸润的影响

目的:探讨生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因沉默介导磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/核因子κB(NF-κB)信号通路对动脉粥样硬化(AS)大鼠脂质沉积和炎性浸润的调控机制。方法:生理盐水组作为对照,构建AS大鼠模型并且将模型大鼠分为如下4组:阴性对照组(转染GRB2 shRNA阴性对照序列)、GRB2 shRNA组(转染GRB2 shRNA序列)、通路抑制剂组(PI3K/AKT通路抑制剂处理)、联合组(GRB2 shRNA序列联合PI3K/AKT通路抑制剂共同处理)。定量即时聚合酶链反应(qRT-PCR)以及蛋白质印迹法检测各组大鼠主动脉PI3KR1、AKT2、NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达。HE染色观察各组大鼠主动脉组织形态。油红O染色对各组大鼠动脉脂质沉积进行定量。酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组大鼠外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C-反应蛋白(CRP)、脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)水平。结果:qRT-PCR、蛋白质印迹法实验结果显示:与生理盐水组相比,PI3K/AKT信号通路在AS大鼠中显著活化(P<0.05);与阴性对照组相比,大鼠经GRB2沉默或PI3K/AKT通路抑制剂处理后,PI3KR1、NF-κB p65蛋白及mRNA,AKT mRNA和p-AKT表达显著下调(均P<0.05)。HE染色结果显示:阴性对照组动脉组织中呈现AS病理表现,沉默GRB2或抑制PI3K/AKT信号通路活性后病理状况改善,联合组改善更明显。油红O染色显示:与阴性对照组相比,GRB2 shRNA组、通路抑制剂组及联合组脂质沉积面积显著减少(均P<0.05)。ELISA结果显示:与阴性对照组相比,单独沉默GRB2、抑制PI3K/AKT通路或两者联合处理后,大鼠外周血TNF-α、CRP、Lp-PLA2表达显著下调(均P<0.05)。结论:下调GRB2能够抑制PI3K/AKT/NF-κB通路,减少AS大鼠主动脉的脂质沉积和炎性浸润,在AS中起保护作用。

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨积雪草酸对急性肺损伤大鼠氧化应激和NLRP3炎症小体的影响

目的 观察积雪草酸对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤大鼠氧化应激和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体相关蛋白的影响,并探讨其相关分子机制。方法 将60只SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组、积雪草酸低剂量组、积雪草酸高剂量组和地塞米松组,每组12只。除对照组外,其余组大鼠均采用LPS气管滴注法建立急性肺损伤模型。模型建立成功后第2天,积雪草酸低、高剂量组大鼠分别腹腔注射25 mg/kg和75 mg/kg积雪草酸溶液,地塞米松组大鼠腹腔注射2 mg/kg地塞米松注射液,对照组和模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水,均1次/d,连续注射8周。HE染色观察大鼠肺组织病理形态,称重法计算肺组织湿/干重比值,TUNEL染色检测大鼠肺组织细胞凋亡情况,试剂盒检测大鼠支气管肺泡灌洗液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量,Western blot法检测肺组织中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Toll样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白88(MyD88)、核转录因子-κB(NF-κB)和磷酸化NF-κB(p-NF-κB)表达情况。结果 与对照组比较,模型组大鼠肺组织可见明显病理损伤,肺组织湿/干重比值、细胞凋亡率、支气管肺泡灌洗液中MDA含量和肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、TLR4、MyD88蛋白相对表达量及p-NF-κB/NF-κB比值均显著升高(P均<0.05),支气管肺泡灌洗液中SOD、GSH-Px含量均显著降低(P均<0.05)。与模型组比较,积雪草酸低、高剂量组和地塞米松组大鼠肺组织病理损伤显著改善,肺组织湿/干重比值、细胞凋亡率、支气管肺泡灌洗液中MDA含量和肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、TLR4、MyD88蛋白相对表达量及p-NF-κB/NF-κB比值均显著降低(P均<0.05),支气管肺泡灌洗液中SOD、GSH-Px含量均显著升高(P均<0.05),且积雪草酸高剂量组和地塞米松组大鼠上述指标变化均显著优于积雪草酸低剂量组(P均<0.05)。结论 积雪草酸可通过抑制氧化应激和NLRP3炎症小体激活减轻LPS诱导的急性肺损伤,其作用机制可能与调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

骨化三醇通过B细胞受体/PI3K/AKT/NF-κB通路抑制大鼠高原肺水肿的发生

目的 :探讨骨化三醇通过B细胞受体/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/核因子κB(NF-κB)通路抑制大鼠高原肺水肿的发生及其机制。方法 :雄性SD大鼠随机分为常氧组、低氧组、低氧+骨化三醇组(0.252μg/kg),连续灌胃给药5 d后,除常氧组外,其余2组均置于模拟海拔6 000 m的低压氧舱内低氧胁迫48h,建立高原肺水肿大鼠模型。干湿比重法测定肺含水量;H-E染色观察大鼠肺组织病理变化,并进行炎症评分;TUNEL法检测肺组织细胞凋亡率;ELISA检测肺组织B细胞激活因子(BAFF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)含量;免疫荧光染色观察肺组织CD21和核因子κB抑制蛋白α(IκBα)的表达;免疫印迹检测肺组织PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)、IκBα、磷酸化IκBα(p-IκBα)的表达。结果 :与常氧组比较,低氧组大鼠肺组织见轻微肺泡隔增宽,炎症细胞浸润;肺含水量升高,肺组织细胞凋亡率、BAFF、TNF-α、IL-6、IFN-γ含量及CD21、p-PI3K、p-AKT表达明显升高;肺组织IL-4、IL-10含量及IκBα、p-IκBα表达明显降低。与低氧组比较,低氧+骨化三醇组炎症细胞浸润减轻;肺含水量降低、肺组织细胞凋亡率、BAFF、TNF-α、IL-6、IFN-γ含量及CD21、p-PI3K、p-AKT表达明显降低;肺组织IL-4、IL-10含量及IκBα、p-IκBα表达明显升高。结论 :骨化三醇可抑制高原肺水肿炎症反应,其作用机制可能与抑制B细胞受体/PI3K/AKT/NF-κB信号通路有关。

中药调控核因子-κB(NF-κB)信号通路治疗银屑病的研究进展

银屑病是一种慢性自身免疫性皮肤病,其核心是免疫反应失调和角质形成细胞增殖异常。核因子-κB(NF-κB)在银屑病中是一种关键的调节信号通路,通过抑制NF-κB信号途径或下游转录因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或白细胞介素-17(IL-17)/白细胞介素-23(IL-23)成为未来银屑病治疗的一个新方向。中药针对NF-κB信号通路在银屑病治疗中具有疗效确切、手段多样、不良反应小等优势。总结了中药调控丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB、NF-κB/信号传导和转录激活因子3(STAT3)、Toll样受体4(TLR4)/NF-κB信号通路治疗银屑病的研究进展,以期为中药治疗银屑病提供更新策略。

水苏碱调节PI3K/Akt/NF-κB信号通路对OGD/R诱导的神经元焦亡的影响

目的探讨水苏碱(Stachydine,STA)对氧糖剥夺再灌注(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导的神经元焦亡及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核转录因子-κB(Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/nuclear transciption factor-kappa B,PI3K/Akt/NF-κB)信号通路的影响机制。方法MTT比色(MTT assay kit,MTT)法检测不同水平STA对海马神经元细胞系Ht22细胞活力的影响;将Ht22细胞进行OGD/R诱导后分为模型组(OGD/R组)、水苏碱低剂量组(STA-L组)、水苏碱中剂量组(STA-M组)、水苏碱高剂量组(STA-H组)、水苏碱高剂量+通路激活剂740Y-P组(STA-H+740Y-P组)、通路激活剂740Y-P组(740Y-P组),另设置正常培养的细胞为对照组(Control组);细胞活性检测试剂(Cell counting kit-8,CCK-8)法检测Ht22细胞增殖活性;Hoechst/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色法检测细胞膜损伤;流式细胞仪检测细胞焦亡;酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测白细胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-18和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平;吸光光度法检测细胞内超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平;2,7-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)荧光染色检测细胞活性氧(Reactive oxygenspecies,ROS)水平;Western blot检测焦亡相关蛋白裂解半胱氨酸蛋白酶-1(Cleaved-caspase-1,C-Caspase-1)、消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)和GSDMD-N和PI3K/Akt/NF-κB信号通路蛋白表达水平。结果STA水平在0.5μmol/L以下不影响Ht22细胞活力,因此采用0.1、0.2、0.5μmol/L STA进行后续实验。与Control组比较,OGD/R组Ht22细胞增殖活性(24、48、72 h)、SOD活性显著降低,红色荧光强度、焦亡率、焦亡蛋白C-Caspase-1,GSDMD和GSDMD-N、炎性因子、MDA,ROS及PI3K/Akt/NF-κB信号通路蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与OGD/R组比较,STA-L,STA-M,STA-H组Ht22细胞增殖活性、SOD活性显著上升,红色荧光强度、焦亡率、焦亡蛋白C-Caspase-1,GSDMD和GSDMD-N、炎性因子、MDA、ROS及PI3K/Akt/NF-κB信号通路蛋白表达水平显著降低(P<0.05);STA-H+740Y-P组与OGD/R组上述指标水平无显著差异(P>0.05);740Y-P组与OGD/R组比较,病理程度显著加重(P<0.05),通路激活剂740Y-P可抵消STA对于神经细胞损伤的保护作用。结论STA可以通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路来减轻OGD/R诱导的Ht22细胞焦亡。

木犀草素通过TLR4/PI3K/AKT通路对子痫前期大鼠胎盘血管生成及细胞凋亡的影响

目的:探究木犀草素通过Toll样受体4(TLR4)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路对子痫前期(PE)大鼠胎盘血管生成及细胞凋亡的影响。方法:SD大鼠随机分为对照组、模型组、木犀草素(40 mg/kg)组、TLR4过表达载体组、TLR4空载组、木犀草素(40 mg/kg)+TLR4过表达载体组,每组12只,除对照组外,其余各组大鼠皮下注射L-精氨酸甲酯(LNAME)制备PE模型,以药物分组处理后,测定各组大鼠妊娠晚期平均动脉压及24 h尿蛋白含量,检测各组大鼠平均子代数目、平均子代体质量、胎盘组织CD31(血管标志物)阳性细胞比例、胎盘细胞凋亡比例,血清炎症因子IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-17水平及胎盘组织凋亡相关蛋白、TLR4/PI3K/AKT通路蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠平均动脉压、24 h尿蛋白含量、胎盘细胞凋亡比例、血清IL-6、TNF-α及IL-17水平、胎盘组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、TLR4、BCL2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白水平显著升高(P<0.05),平均子代数目、平均子代体质量、胎盘组织CD31阳性细胞比例、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组、木犀草素+TLR4过表达载体组分别相比,木犀草素组大鼠平均动脉压、24 h尿蛋白含量、胎盘细胞凋亡比例、血清IL-6、TNF-α及IL-17水平、胎盘组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、TLR4、Bax、caspase-3蛋白水平均显著降低(P<0.05),平均子代数目、平均子代体质量、胎盘组织CD31阳性细胞比例、Bcl-2蛋白表达均显著升高(P<0.05),TLR4过表达载体组大鼠平均动脉压、24 h尿蛋白含量、胎盘细胞凋亡比例、血清IL-6、TNF-α及IL-17水平、胎盘组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、TLR4、Bax、caspase-3蛋白水平均显著升高(P<0.05),平均子代数目、平均子代体质量、胎盘组织CD31阳性细胞比例、Bcl-2蛋白表达均显著降低(P<0.05)。与模型组相比,TLR4空载组大鼠各指标水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:木犀草素可通过下调TLR4/PI3K/AKT通路表达,降低PE大鼠平均动脉压,缓解妊娠后期高血压与蛋白尿症状,抑制炎症,增强胎盘血管生成,减轻胎盘组织损伤及细胞凋亡,提高妊娠大鼠子代存活率。

基于肠黏膜屏障及TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨燮和饮改善PCOS-IR小鼠炎症反应的影响

目的:探讨燮和饮对改善肥胖型多囊卵巢综合征胰岛素抵抗(PCOS-IR),减缓炎症反应的可能作用机制。方法:将60只SPF级雌性C57BL/6J小鼠随机抽取10只,并设为正常组,其余小鼠均采用粪菌混悬液(2 g·kg^(-1))联合来曲唑溶液(0.002 g·kg^(-1))灌胃4周建立PCOS-IR模型。将模型复制成功的动物随机分为模型组,二甲双胍组(0.25 g·kg^(-1))及燮和饮低、中、高剂量组(10,20,40 g·kg^(-1)),给予相应剂量的药物灌胃,每天1次,连续治疗4周。除空白组外,其余各组小鼠在治疗期间持续灌胃粪菌混悬液和来曲唑溶液以维持模型。动物每周称1次体质量;治疗结束后测量空腹血糖(FBG);酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清睾酮(T),促卵泡生成素(FSH),促黄体生成素(LH),空腹胰岛素(FINS)水平,计算LH/FSH及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)值;摘取子宫和双侧卵巢称质量后固定,苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织病理形态学变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠结肠组织中Toll样受体4/核转录因子-κB/NOD样受体蛋白3(TLR4/NF-κB/NLRP3)信号通路及下游炎症相关因子半胱氨酸天冬氨酸水解酶-1(Caspase-1),白细胞介素-1β(IL^(-1)β),紧密连接蛋白-1(ZO-1),闭合蛋白(occludin)表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠体质量显著升高(P<0.01);血清FBG,FINS和HOMA-IR明显升高(P<0.05);血清T,LH/FSH显著升高(P<0.01);子宫脏器比显著降低(P<0.01),卵巢脏器比显著升高(P<0.01),镜下可见卵巢中囊性扩张卵泡及闭锁小卵泡数量明显增多,黄体数量显著减少,卵泡颗粒细胞层减少,卵泡膜显著增厚;结肠组织中ZO-1,occludin的相对表达量显著下调(P<0.01),炎症相关蛋白TLR4,NF-κB,NLRP3,Caspase-1,IL^(-1)β表达量明显上调(P<0.05)。与模型组比较,燮和饮低、中、高剂量组小鼠体质量显著降低(P<0.01);燮和饮中、高剂量组血清FBG,FINS,HOMA-IR明显降低(P<0.05);高剂量组血清T,LH/FSH显著降低(P<0.01);卵巢脏器比明显降低(P<0.05),子宫脏器比显著升高(P<0.05),卵巢中囊状卵泡明显减少,内见黄体,卵巢颗粒细胞正常排列,卵泡膜略增厚;高剂量组结肠组织TLR4,NF-κB,NLRP3,Caspase-1,IL^(-1)β蛋白表达显著下调(P<0.01),ZO-1,occludin蛋白表达量显著上调(P<0.01)。结论:燮和饮调控肠道TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,减少下游炎症因子释放,通过重建肠黏膜屏障功能及抑制肠道炎症反应,改善肥胖和IR,从而逆转PCOS-IR。

基于NLRP3炎性小体和TLR4/NF-κB信号通路探讨黄连解毒汤治疗急性痛风性关节炎的作用机制

目的:观察黄连解毒汤对急性痛风性关节炎(AGA)模型小鼠炎性损伤的影响,探讨黄连解毒汤治疗AGA的作用机制。方法:40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组和黄连解毒汤组。采用踝关节注射单钠尿酸盐(MSU)晶体混悬液建立小鼠AGA模型,给药组分别给予黄连解毒汤水煎液(5 g·kg^(-1))和秋水仙碱(0.83 mg·kg^(-1)),每天测量小鼠右踝关节肿胀程度,7 d后苏木素-伊红(HE)染色检测踝关节组织病理改变。另外40只C57BL/6J小鼠同样分组处理,造模18 h后,取右踝关节,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测关节炎症因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6和NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1(Caspase‑1)mRNA的表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6含量;蛋白免疫印迹法(Western bolt)检测NLRP3炎性小体和Toll样受体4/核转录因子-κB(TLR4/NF-κB)信号通路蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠右踝关节显著肿胀(P<0.01),HE染色观察到踝关节明显异物肉芽肿,其间有炎症细胞浸润,黄连解毒汤干预后可以缓解踝关节肿胀(P<0.05,P<0.01),异物肉芽肿减小。与正常组比较,模型组踝关节组织中炎症因子IL-1β含量和IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达显著升高(P<0.01),NLRP3炎性小体、Caspase‑1 mRNA表达明显升高(P<0.05,P<0.01),NLRP3、Caspase-1、TLR4和NF-κB蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,黄连解毒汤干预明显降低炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和NLRP3炎性小体、Caspase‑1 mRNA表达(P<0.05,P<0.01),显著降低关节组织中炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6含量(P<0.01),下调NLRP3、Caspase‑1、TLR4、NF-κB蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)。结论:注射MSU晶体导致AGA小鼠关节局部炎性免疫损伤,黄连解毒汤干预减轻炎性免疫损伤,可能与其调控NLRP3炎性小体和TLR4/NF-κB信号通路相关。

加味三仁汤对免疫球蛋白A肾病大鼠PI3K/AKT/NF-κB信号通路的影响

目的:研究加味三仁汤对免疫球蛋白A肾病(immunoglobulinA nephropathy,IgAN)大鼠肾脏的保护作用及其对PI3K/AKT/NF-κB信号通路的调控作用,探讨加味三仁汤治疗IgA肾病的机制。方法:采用牛血清白蛋白(BSA)400 mg/kg灌胃+四氯化碳(CCl;)0.1 mL皮下注射+脂多糖(LPS)0.05 mg尾静脉注射方法建立实验性IgA肾病(IgAN)大鼠模型。造模成功大鼠随机分为模型对照组、贝那普利0.01 g/kg组、加味三仁汤10.35 g/kg组,另取正常大鼠作为对照。各组给予相应的药物干预,灌胃体积8 mL/kg,1次/d,连续给药4 w后检测大鼠24 h尿蛋白(24-UTP)、血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)含量,同时检测炎性因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量;苏木精-伊红(HE)染色,观察肾脏组织病理形态学变化;免疫组化法、蛋白质印迹法(Western blot)和反转录·聚合酶链反应法(RT-PCR)分别检测PI3K/AKT/NF-κB通路相关蛋白和基因的表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠24 h-UTP显著升高,血清白蛋白含量显著降低,IL-1β、IL-18、MCP-1含量均显著升高(P<0.01)。肾小球基底膜增厚,细胞外基质增多,系膜扩张;PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关蛋白及基因表达显著改变(P<0.01)。与模型对照组比较,加味三仁汤10.35 g/kg组24 h-UTP显著降低(P<0.01),血清白蛋白含量明显升高(P<0.05),IL-1β、IL-18水平显著降低(P<0.01),MCP-1含量明显降低(P<0.05);肾脏组织病变明显改善,明显抑制肾组织中PI3K、AKT蛋白磷酸化及下调mRNA,下调NF-κB蛋白及mRNA表达,同时上调PTEN蛋白及mRNA表达。结论:加味三仁汤可能通过调控PI3K/AKT/NF-κB信号通路改善IgA肾病大鼠的肾组织损伤状况,延缓IgA肾病的发生发展。

PP2C蛋白磷酸酶调控的细胞信号通路研究进展

2C类蛋白磷酸酶是蛋白磷酸酶家族的重要成员,可以对丝/苏氨酸残基特异性脱磷酸。近来研究表明,2C类蛋白磷酸酶控制着大量关键的细胞功能,如增殖、细胞周期阻滞、衰老和细胞程序性死亡、凋亡和自噬等,因而在介导机体免疫反应、衰老、神经发育及肿瘤发生发展中发挥重要的生物学作用。总结PP2C基因各亚型参与介导的重要细胞信号通路,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)、转化生长因子-β(TGF-β)/Smads、核转录因子-κB(NF-κB)及DNA损伤应答通路,以期为阐明上述生理病理过程的分子基础和调控机制提供新的思路。

下调高迁移率族蛋白B1对宫颈癌细胞侵袭、迁移的影响及机制

目的观察下调高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对宫颈癌细胞侵袭、迁移的影响,并探讨其机制。方法将宫颈癌Si Ha细胞随机分成对照组和实验组,分别加入0.01%DMSO和HMGB1抑制剂正丁酸钠0.5 mmol/L作用24 h。采用Transwell小室实验观察两组细胞侵袭、迁移能力,RT-PCR法和Western blotting法检测两组HMGB1及Toll样受体4(TLR4)/核因子-кB(NF-кB)信号通路相关分子[TLR4、NF-кB、整合素av、整合素β3、原肌球蛋白1(TPM1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)]、TLR4/PI3K/Akt信号通路相关分子[磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(pPI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、整合素β1]。结果实验组迁移和侵袭实验中的穿膜细胞数均少于对照组(P均<0.05)。与对照组相比,实验组HMGB1、TLR4、NF-кB p65、整合素av、整合素β3、整合素β1 mRNA和蛋白表达下降,TPM1、maspin mRNA和蛋白表达升高(P均<0.05)。结论在宫颈癌细胞中,下调HMGB1可以通过影响TLR4/NF-кB和TLR4/PI3K/Akt信号通路,促进宫颈癌细胞的侵袭和迁移。

达原饮调控TLR/MAPK/NF-κB通路防治H1N1感染诱发急性肺损伤的作用机制

目的:探究达原饮对H1N1感染诱发的急性肺损伤的药效及其潜在机制。方法:使用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱仪对达原饮水煎液进行药物成分分析。将48只雌性BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、奥司他韦组(19.5 mg·kg^(-1))、达原饮低、中、高剂量组(2.73、5.46、10.92 g·kg^(-1))。正常组和模型组给予去离子水灌胃,其他各组给予对应药物灌胃。给药第3天,正常组给予生理盐水滴鼻,其他各组在鼻内接种A/RP/8/34(H1N1)构建流感病毒感染的动物模型。连续给药7 d,每日称体质量。末次给药12 h后进行取材,肺组织称重,计算肺指数;苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织及支气管病理形态学变化;微球免疫分析系统(CBA)检测血清中的γ干扰素(IFN-γ)、趋化因子(C-X-C基序)配体1(CXCL1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、趋化因子配体2(CCL2)、白细胞介素-12p70(IL-12p70)、趋化因子配体5(CCL5)、白细胞介素-1β(IL-1β)、趋化因子(C-X-C基序)配体10(CXCL10)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-10(IL-10)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-α(IFN-α)、白细胞介素-6(IL-6)。基于质谱结果联合网络药理学,分析达原饮防治甲流病毒引起的急性肺损伤的作用机制。通过蛋白免疫印迹法(Western bolt)检测肺组织中的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、核转录因子-κB(NF-κB),及其磷酸化蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肺组织中的髓样分化因子88(MyD88)、Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体7(TLR7)、Toll样受体8(TLR8)的mRNA表达。结果:质谱分析确定达原饮水煎液中含有芍药苷、黄芩素等57种化合物。与正常组比较,模型组小鼠体质量下降(P<0.01),肺部水肿和出血,肺指数升高(P<0.01),IFN-γ、IL-12p70、CCL5、IL-1β、CXCL10、GM-CSF、IFN-β、IL-6显著升高(P<0.01)。与模型组比较,达原饮治疗组小鼠肺泡壁增厚、毛细血管充血和免疫细胞浸润的病理变化明显减轻,体质量和肺指数改变减轻(P<0.01),IFN-γ、IL-12p70、CCL5、IL-1β、CXCL10、GM-CSF、IFN-β、IL-6蛋白表达量显著下降(P<0.01);网络药理学分析共获得57个关键基因,其中MAPK信号通路为主要的靶向信号通路。与正常组比较,模型组小鼠肺组织的p-ERK1/2、p-p38MAPK、p-NF-κB表达上升(P<0.01),TLR7、TLR8、MyD88、TLR3的mRNA表达上升(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,达原饮治疗组表现出剂量依赖性地抑制ERK1/2、p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平(P<0.01),同时能够下调TLR3、TLR7、TLR8、MyD88的mRNA表达(P<0.01)。结论:达原饮能够通过抑制TLR/MAPK/NF-κB信号通路,有效防治H1N1感染诱发的急性肺损伤。

基于TLR2/p38 MAPK/NF-κB信号通路探讨独活寄生汤对类风湿性关节炎大鼠的抗炎作用及机制

目的:探讨独活寄生汤对胶原诱导性关节炎(CIA)模型大鼠的抗炎作用及其对Toll样受体2(TLR2)/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:将48只雄性SD大鼠,随机分为以下6组(n=8),正常组、模型组、甲氨蝶呤组、独活寄生汤低、中、高剂量组。采用胶原抗体诱导法于大鼠尾根部注射牛Ⅱ型胶原蛋白建立CIA大鼠模型,模型建立成功后进行灌胃给药。甲氨蝶呤组每次给予2.0 mg·kg^(-1)甲氨蝶呤,每周3次;独活寄生汤低、中、高剂量组每次给予3.8、7.6、15.2 g·kg^(-1)·d^(-1),连续灌胃治疗28 d;正常组和模型组给予等体积生理盐水。通过记录大鼠体质量,观察大鼠足肿胀度,测定关节炎指数、免疫器官指数,微循环检测仪检测大鼠微循环指标变化,苏木素-伊红(HE)染色检测大鼠滑膜组织病理形态的改变及流式细胞术检测滑膜细胞凋亡率以明确独活寄生汤对类风湿性关节炎的治疗作用,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-17A、γ干扰素(IFN-γ)水平变化,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TLR2、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠体质量显著降低(P<0.01),足肿胀度、关节炎指数及免疫器官指数显著升高(P<0.01),微血管综合评分及血管阻力显著提高(P<0.01),病理切片可观察到滑膜组织增生明显、炎性细胞大量浸润,血清中TNF-α、IL-1β、IL-17A和IFN-γ表达及滑膜组织TLR2、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK的表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,独活寄生汤低、中、高剂量组大鼠体质量显著升高(P<0.01),足肿胀度、关节炎指数及免疫器官指数明显下降(P<0.05,P<0.01),微血管综合评分及血管阻力明显下降(P<0.05,P<0.01),滑膜组织病理学损伤情况明显好转,滑膜细胞凋亡率显著升高(P<0.01),血清中TNF-α、IL-1β、IL-17A和IFN-γ水平明显下降(P<0.05,P<0.01),滑膜组织TLR2、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38MAPK/p38 MAPK的表达水平均明显下降(P<0.05,P<0.01)。结论:独活寄生汤可能通过调节TLR2/p38 MAPK/NF-κB信号通路缓解CIA大鼠体内炎症反应,从而发挥其抗类风湿性关节炎作用。

重症脑梗死患者肺部感染病原菌及其MAPK、TLR4/NF-κB信号通路变化

目的 探讨重症脑梗死患者肺部感染的病原菌分布及对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)通路的影响。方法 回顾性分析130例2019年1月-2023年1月武汉市汉口医院收治的重症脑梗死患者的临床资料,根据重症脑梗死患者是否发生肺部感染分为感染组(35例)与未感染组(95例)。分析重症脑梗死患者肺部感染的病原菌分布特点;比较两组临床资料、MAPK、TLR4/NF-κB通路指标变化,采用单因素及多因素分析重症脑梗死患者肺部感染危险因素,建立模型,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析预测模型对重症脑梗死患者肺部感染发生的预测价值。结果 重症脑梗死患者肺部感染病原菌分布以革兰阴性菌为主;Logistic回归分析显示,有侵入性治疗、有糖尿病、有意识功能障碍是重症脑梗死患者肺部感染危险因素(P<0.05);构建危险因素模型,Logit(P)=-10.377+有侵入性治疗×0.843+有糖尿病×0.648+有意识功能障碍×0.943;绘制ROC曲线,当Logit(P)>12时,曲线下面积(AUC)值为0.824,95%CI为0.747~0.885,χ^(2)=7.886,敏感度为74.29%,特异度为74.74%。结论 重症脑梗死患者肺部感染发生率较高,病原菌以革兰阴性菌居多,且MAPK、TLR4/NF-κB通路被激活;与侵入性治疗、血清TLR4、NF-κB、静脉血细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)水平相关,且危险因素模型预测价值较高。

葛根芩连汤对KKAy糖尿病小鼠TLR4/IKKβ/NF-κB信号通路的影响

目的:观察经方葛根芩连汤对KKAy小鼠部分炎性因子及脂多糖介导的炎症通路中关键靶点的影响,探讨其改善2型糖尿病的作用机制。方法:选取SPF级自发性2型糖尿病动物模型KKAy小鼠65只及对照C57BL/6J小鼠13只予屏障系统、高脂饲料喂养,随机血糖≥13.9 mmoL·L^(-1),为成模小鼠44只。随机分为5组,每组11只。正常组(生理盐水20 mL·kg^(-1))、阿卡波糖组(3.9 mg·kg^(-1))、葛根芩连汤高、低剂量组(1.82、0.45 g·kg^(-1))及模型组(生理盐水20 mL·kg^(-1)),连续灌胃给药8周,1次/d,系统评价血糖及体质量。末次给药12 h后,摘眼球取血,提取血清及肌肉、肝脏组织。采用半定量酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及葡萄糖转运子4(GluT4)含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肌肉组织IκB磷酸化激酶β(IKKβ)蛋白、核转录因子-κB(NF-κB)及肝组织Toll样受体4(TLR4)蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组体质量及血糖显著升高(P<0.01);与模型组比较,阿卡波糖组及葛根芩连汤组能够明显降低体质量及血糖水平(P<0.05,P<0.01)。ELISA结果显示,与正常组比较,模型组炎性因子TNF-α、IL-6含量显著升高(P<0.01),GluT4含量明显下降(P<0.05);与模型组比较,各给药组炎性因子TNF-α、IL-6含量均有不同程度下降(P<0.05,P<0.01),阿卡波糖组与葛根芩连汤高剂量组GluT4含量明显升高(P<0.05,P<0.01)。Western blot分析显示,与正常组比较,模型组IKKβ、NF-κB及TLR4蛋白表达均有升高(P<0.01);与模型组比较,阿卡波糖组与葛根芩连汤组IKKβ、NF-κB及TLR4蛋白表达均明显下降(P<0.05,P<0.01)。结论:葛根芩连汤可能在调节肠道菌群的基础上,通过下调TLR4通路中关键炎性因子的水平,抑制其激活,提高GluT4的转位及活性水平,从而在一定程度上抑制炎性级联效应,改善2型糖尿病。

基于PI3K/Akt/NF-κB信号通路探讨加味三仁汤对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的:观察加味三仁汤对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的干预作用,探讨其改善免疫球蛋白A肾病(IgAN)大鼠炎症病变的相关机制。方法:采用血清药理学方法,将18只大鼠分为3组,正常组,加味三仁汤高、低剂量(20.70,10.35 g·kg^(-1)·d^(-1))组,每组6只,加味三仁汤高、低剂量组给予加味三仁汤相应溶液灌胃,正常组灌胃等体积蒸馏水。分别灌胃5 d后,采血制取含药血清。采用大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1),分为正常组,模型组,贝那普利组(50μmol·L^(-1)),加味三仁汤高、低剂量组。采用噻唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞增殖情况,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞培养上清液中Ⅳ型胶原(ColⅣ)的含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分别检测PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白表达量和mRNA表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠肾小球系膜细胞增殖显著(P<0.01),ColⅣ分泌显著增多(P<0.01),磷酸化(p)-Akt,p-p65蛋白表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,加味三仁汤高剂量组显著抑制细胞增殖(P<0.01)和ColⅣ分泌(P<0.01),降低Akt磷酸化水平(P<0.01),降低NF-κB p65阳性表达(P<0.01)。结论:加味三仁汤能够抑制脂多糖诱导的HBZY-1细胞增殖,降低ColⅣ蛋白含量,可能与其抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活密切相关。

中药治疗下肢深静脉血栓相关信号通路研究进展

下肢深静脉血栓形成(DVT)是常见的血管外科疾病,可诱发肺动脉栓塞和深静脉血栓形成后综合征,进而严重影响患者的生活质量。既往研究发现,下肢深静脉血栓的形成和发病与炎症反应密切相关,其中核转录因子Kappa B、Toll样受体、肿瘤坏死因子等信号通路参与其中。研究证实,中医药治疗DVT效果显著,临床应用广泛。中药单体、有效成分和复方可通过调控上述信号通路抑制炎症反应,通过保护内皮细胞和抑制血小板活化等途径,从而干预DVF。本文对中药治疗DVT的相关信号通路进行归纳,旨在为中医药治疗DVT的基础研究提供理论参考,为中医药治疗深静脉血栓形成的临床应用提供依据。

多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗相关信号通路的研究进展

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种好发于青春期及育龄期女性的涉及诸多因素的内分泌代谢性疾病,临床主要表现为闭经、体胖、多毛痤疮以及妊娠率显著降低,但目前其病因病机尚不清楚。胰岛素抵抗(IR)与多种慢性非传染性疾病(高血压、糖尿病、心脑血管疾病、PCOS等)相关,目前已知磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B、肝激酶B1/AMP活化的蛋白激酶、沉默信息调节因子1/叉头框转录因子O1、Toll样因子4/核因子κB信号通路参与了PCOS伴IR(PCOS-IR)的作用机制,因此充分认识PCOS-IR的发病机制在疾病预防中有重要临床意义。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3和PI3K/Akt通路研究甘遂及其炮制品对水负荷小鼠的利尿作用及机制

目的研究甘遂及其炮制品对水负荷小鼠的利尿作用及机制。方法通过网络药理学探究甘遂的利尿作用机制。ICR小鼠给予甘遂及其炮制品后,ig大量生理盐水建立水负荷模型,测定水负荷差值及脏器指数;取十二指肠及空肠,观察病理变化;采用ELISA法测定小鼠血清中炎性因子指标白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-18、IL-4、IL-10及小肠组织中氧化应激指标丙二醛(malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;采用Western blotting测定小鼠小肠组织中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、磷脂肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)蛋白表达。结果通过构建“中药-成分-疾病-通路-靶点”网络及通路富集分析得到甘遂及其炮制品主要通过参与氧化应激反应及PI3K/Akt等信号通路调节水肿。体内实验结果显示,与模型组比较,各给药组小鼠水负荷差值在各个时间段均显著升高(P<0.01);血清中IL-1β、IL-18及小肠组织MDA水平均显著降低(P<0.05、0.01),血清中IL-4、IL-10及小肠组织GSH水平均显著升高(P<0.05、0.01);小肠组织TLR4、NLRP3、p-NF-κB/NF-κB、p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。在各给药组中,1~6 h甘遂的利尿作用最强,醋甘遂和甘草制甘遂的利尿作用均有所缓解,说明甘遂经炮制后会缓和其刺激性而平衡其利尿作用。结论甘遂及其炮制品对水负荷小鼠均可以不同程度地抗水负荷并产生利尿作用,并可以通过抑制TLR4通道介导的NF-κB/NLRP3信号通路及PI3K/Akt信号通路从而抑制IL-1β和IL-18的表达。