伏立诺他调节高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4信号通路对脑出血小鼠神经功能损伤的影响

目的 探讨伏立诺他(SAHA)调节高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll样受体4(TLR4)信号通路对脑出血(ICH)小鼠神经功能损伤的影响。方法 通过注射Ⅶ型胶原酶建立ICH小鼠模型。将造模小鼠随机分为ICH组、SAHA组(15 mg/kg SAHA)、重组高迁移率组蛋白B1(rHMGB1)组(16μg/kg rHMGB1)、SAHA+rHMGB1组(16μg/kg rHMGB1+15 mg/kg SAHA),每组10只;以不注射Ⅶ型胶原酶的10只小鼠为假手术组。干预结束后,对小鼠进行神经功能缺损评分(NDS),检测小鼠认知障碍状况及脑水肿变化、血清TNF-α及IL-1β水平、神经元细胞凋亡数量、血肿周围组织中HMGB1/TLR4通路相关蛋白的表达。结果 与ICH组比较,假手术组、SAHA组NDS评分、脑水肿率、神经元凋亡数量、TNF-α水平、IL-1β水平及HMGB1、TLR4蛋白表达显著降低,分辨指数显著升高(均P<0.05),rHMGB1组NDS评分、脑水肿率、神经元凋亡数量、TNF-α水平、IL-1β水平及HMGB1、TLR4蛋白表达显著升高,分辨指数显著降低(均P<0.05)。与SAHA+rHMGB1组比较,SAHA组NDS评分、脑水肿率、神经元凋亡数量、TNF-α水平、IL-1β水平及HMGB1、TLR4蛋白表达显著降低,分辨指数显著升高(均P<0.05),rHMGB1组NDS评分、脑水肿率、神经元凋亡数量、TNF-α水平、IL-1β水平及HMGB1、TLR4蛋白表达显著升高,分辨指数显著降低(均P<0.05)。结论 SAHA抑制HMGB1/TLR4信号通路的炎症反应,改善ICH小鼠神经功能。

抵当汤对高速泳动族蛋白B1/Toll样受体4/核因子κB通路的调控作用

目的:探讨抵当汤及其拆方对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症反应的影响及作用机制。方法:将体外培养的HUVECs随机分为空白血清组、LPS组、LPS+抵当汤组、LPS+植物药组、LPS+动物药组;抑制Toll样受体4(TLR4)后分为TAK-242组、抵当汤TAK-242组、植物药TAK-242组、动物药TAK-242组,给予相应处理后,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞上清中高速泳动族蛋白B1(HMGB1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)含量;蛋白质免疫印迹法检测HUVECs中HMGB1、TLR4和核因子κB p65的蛋白表达水平,实时定量PCR(RT-qPCR)法检测HMGB1、TLR4和核因子κB p65的基因表达情况,免疫荧光法测定HMGB1、TLR4和核因子κBp65的荧光强度。结果:与A组比较,LPS组细胞上清液及HUVECs中HMGB1、IL-6、TNF-α、TLR4和核因子κB p65表达均增强(均P<0.01)。与LPS组比较,LPS+抵当汤组细胞上清液及HUVECs中的HMGB1、IL-6、TNF-α、TLR4和核因子κBp65的表达均减弱(P<0.05,P<0.01)。与LPS+抵当汤组比较,LPS+植物药组和LPS+动物药组细胞上清液及HUVECs中的HMGB1、IL-6、TNF-α、TLR4和核因子κBp65表达显著增强(P<0.05,P<0.01)。LPS+植物药组中的HMGB1、IL-6和TNF-α表达低于LPS+动物药组(P<0.05,P<0.01),TLR4和核因子κBp65表达高于LPS+动物药组(P<0.05)。抑制TLR4后,与LPS组比较,TAK-242组的HMGB1、TLR4、核因子κBp65表达减弱(P<0.05,P<0.01)。与TAK-242组比较,抵当汤TAK-242组各指标表达低于TAK-242组(P<0.05,P<0.01)。与抵当汤TAK-242组比较,植物药TAK-242组和动物药TAK-242组各指标表达水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论:抵当汤及其拆方可通过抑制细胞炎症反应对HUVECs发挥保护和改善作用,其作用机制可能与抑制HMGB1/TLR4/核因子κB信号通路活化有关。

基于高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4信号通路分析血栓通注射液联合阿替普酶静脉溶栓治疗对急性脑梗死患者的机制研究

目的基于高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4(HMGB1/TLR4)信号通路分析血栓通注射液联合阿替普酶静脉溶栓治疗对急性脑梗死(ACI)患者的作用机制。方法将106例ACI患者随机分为对照组(n=53)与研究组(n=53)。对照组进行阿替普酶静脉溶栓治疗,研究组在对照组基础上应用血栓通注射液治疗。比较2组临床疗效与不良反应,治疗前及治疗后7、14 d的美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分,治疗前后的外周血单个核细胞内HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达水平及血清中HMGB1、TLR4蛋白含量,以及治疗前后炎症因子[白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平。采用Pearson检验和Spearman检验分析ACI患者外周血单个核细胞内HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达水平及血清中HMGB1、TLR4蛋白含量与NIHSS评分、疗效总有效率的相关性。结果治疗后7、14 d时,研究组NIHSS评分低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,2组HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达水平较治疗前降低,且研究组HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,2组血清HMGB1、TLR4蛋白含量较治疗前降低,且研究组血清HMGB1、TLR4蛋白含量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,2组血清TNF-α、IL-6水平低于治疗前,且研究组血清TNF-α、IL-6水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组总有效率为75.47%,研究组总有效率为94.34%,差异有统计学意义(P<0.05);对照组不良反应总发生率为9.43%,研究组不良反应总发生率为15.09%,差异无统计学意义(P>0.05)。Pearson检验显示,ACI患者外周血单个核细胞内HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达水平及血清中HMGB1、TLR4蛋白含量与NIHSS评分呈正相关(r=0.431、0.443、0.396、0.375,P均<0.001);Spearman检验显示,ACI患者外周血单个核细胞内HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达水平及血清中HMGB1、TLR4蛋白含量与疗效总有效率呈负相关(r=-0.536、-0.481、-0.475、-0.506,P均<0.001)。结论血栓通注射液联合阿替普酶静脉溶栓治疗能有效改善ACI患者神经功能并降低机体炎症水平,其机制可能与下调HMGB1/TLR4信号通路有关。

基因芯片研究云芝糖肽对健康成人外周血单个核细胞Toll样蛋白受体信号转导通路的影响

目的利用基因芯片技术检测PSP对健康成人外周血单个核细胞(PBMC)Toll样蛋白信号转导通路的影响,探索云芝糖肽的免疫调节作用机制。方法体外分离、培养健康成人外周血单个核细胞,摸索云芝糖肽的最佳作用浓度,再分为对照组、云芝糖肽组,72h后收获细胞抽提总RNA,应用Toll样蛋白受体信号转导基因芯片检测PSP对健康成人外周血单个核细胞TLRs信号传导通路中相关基因的变化。结果12.5μg/mL的云芝糖肽可显著促进健康成人PBMC增殖转化(P<0.01);经云芝糖肽作用后上调≥2倍的基因有22个,占18.8%(如γ-干扰素、干扰素-γ-诱导蛋白-10等),下调≥2倍的基因有23项,占19.7%(如Toll作用蛋白、共刺激分子CD86等)。结论云芝糖肽可以调节免疫细胞Toll样蛋白受体转导途径中相关基因的表达,为进一步探讨云芝糖肽的免疫调节作用机理提供了依据。

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠黏膜Toll样受体蛋白的影响

目的:观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠结肠黏膜Toll样受体(TLR)蛋白的影响。方法:采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇混合溶液灌肠复制溃疡性结肠炎大鼠模型。实验设正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组和泄浊解毒方小、大剂量组,分别处理与给药后,观察各组大鼠结肠组织TLR2、TLR4蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠TLR2、TLR4均显著升高;与模型组比较,泄浊解毒方各剂量组和柳氮磺胺吡啶组TLR2、TLR4明显降低;而泄浊解毒方大剂量组TLR2、TLR4蛋白表达,泄浊解毒方小剂量组TLR2蛋白表达亦明显低于柳氮磺胺吡啶组。结论:泄浊解毒方对大鼠溃疡性结肠炎有良好的治疗作用,其作用机制可能与调节Toll样受体蛋白有关。

高迁移率蛋白1/Toll样受体4信号通路与下肢动脉硬化闭塞症介入治疗后复发的相关性分析

目的研究高迁移率蛋白1/Toll样受体4信号通路(HMGB1/TLR4)与老年下肢动脉硬化闭塞症(ASO)介入治疗后复发风险的相关性。方法2020年1月~2021年1月间收治的行介入治疗的ASO病人84例,共96条病变血管,采用逆转录实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法于术后1周检测病人外周血单个核细胞(PBMCs)内HMGB1及TLR4 mRNA表达水平,放射免疫法及免疫比浊法检测血清内皮素-1(ET-1)及高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平。术后随访12个月,统计靶血管再狭窄情况,将血管再狭窄者纳为复发组,无狭窄者纳为对照组,比较两组外周血PBMCs内HMGB1、TLR4水平及血清hs-CRP及ET-1水平,分析以上指标与ASO介入术治疗病人血管再狭窄之间的关系。结果介入治疗后,84例病人96条病变血管均开通,随访12个月后经双下肢超声及CTA检查提示有16例病人共18条病变血管再狭窄。复发组病人外周血PBMCs内HMGB1及TLR4表达水平及血清ET-1及hs-CRP高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。复发组病人外周血PBMCs的HMGB1及TLR4表达量与血清ET-1及hs-CRP水平均呈正相关(r=0.393,0.378,0.411,0.407,P<0.05)。结论HMGB1/TLR4信号通路可能通过激活炎症因子释放,促进血管损伤,参与ASO病人介入术后复发。

光化性角化病病人皮肤组织Toll样受体7蛋白表达及其临床意义

目的探讨光化性角化病(AK)病人皮肤组织中Toll样受体7(TLR7)蛋白表达及其对AK病人预后的预测效能。方法选取2015年1月至2019年1月四川大学华西医院收集的134例AK病人的皮肤蜡块标本作为观察组,选取同时期收集的129例健康人员的皮肤蜡块标本作为对照组。采用免疫组化法测定两组皮肤组织的TLR7蛋白表达情况,比较两组皮肤组织TLR7蛋白表达水平。对观察组病人随访3年,根据是否发展为皮肤鳞状细胞癌(cSCC)分为癌变组和非癌变组,对比癌变组与非癌变组皮肤组织中TLR7蛋白表达水平,采用单因素分析和logistic回归模型分析AK病人进展为cSCC的影响因素,采用受试者操作特征(ROC)曲线分析皮肤组织TLR7蛋白表达水平对AK病人发生cSCC的预测效能。结果观察组皮肤组织中TLR7蛋白表达水平高于对照组(23.76±3.90比4.95±0.64)(P<0.05);AK病人cSCC发生率为15.67%;癌变组与非癌变组皮肤病史、病程、病理类型比较差异无统计学意义(P>0.05),癌变组年龄高于非癌变组(P<0.05),男性、Fitzpatrick皮肤分型为Ⅰ/Ⅱ型的比例及皮肤组织TLR7蛋白表达量高于非癌变组(P<0.05);高龄、男性、Fitzpatrick皮肤分型为Ⅰ/Ⅱ型、皮肤组织TLR7蛋白高表达均为AK病人癌变发生的独立危险因素(P<0.05),且该模型拟合效果良好(P>0.05);皮肤组织TLR7蛋白表达预测AK病人进展为cSCC的ROC曲线的截断值25.34,灵敏度80.95%,特异度81.42%,ROC曲线下面积0.81,95%CI:(0.74,0.88)。结论AK病人皮肤组织中TLR7蛋白的表达量升高,且是AK病人继发cSCC的独立危险因素,对AK病人的预后具有良好预测效能。

对Toll样受体研究的新认识

Toll样受体(TLR)是一类典型的模式识别受体(PRR),一组与天然免疫密切相关的受体家族。PAMP主要是指广泛存在于病原体细胞表面的分子标志,它们在进化中趋于保守,TLR可对PAMP进行识别。在TLR家族中,TLR4和TLR2起到了主导的作用,革兰阳性菌脂多糖(LPS)受体为TLR4,革兰阴性菌脂磷壁酸(LTA)受体主要为TLR2。它们通过引发细胞的信号转导系统最终导致炎性介质的释放,在天然免疫防御中起重要作用,并对其后产生的适应性免疫起到至关重要的作用。TLR基因多态性与机体对疾病的遗传易感性密切相关,TLR在识别病原微生物、启动炎性应答中起重要作用。对TLR及天然免疫激活过程的研究,必然对免疫学的再认识与发展产生深远的影响,为疾病的诊断和治疗提供新的重要理论依据。

柯里拉京对小鼠单纯疱疹病毒性脑炎Toll样受体3-干扰素诱导链接蛋白通路的调控机制研究

目的:通过柯里拉京(Cor)干预单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)小鼠模型,阐明柯里拉京对Toll样受体3(TLR3)信号通路的调控机制。方法:通过颅内注射单纯疱疹病毒1型(HSV1)建立单纯疱疹病毒性脑炎小鼠模型,每天定时灌胃1次等体积的柯里拉京或生理盐水,在第5天断头处死小鼠,取出右侧颞叶病变脑组织进行苏木精-伊红(HE)染色,在显微镜下观察小鼠脑组织病理改变,通过定时定量PCR检测TLR3及其下游信号分子TLR结构域的干扰素诱导链接蛋白(TRIF)mRNA的表达情况,Western blot检测TLR3、TRIF蛋白表达情况,ELISA法检测炎性组织细胞内干扰素α(IFN-α)的分泌情况。结果:HSE小鼠模型中TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α的分泌均高于正常对照组(P<0.01);柯里拉京干预可有效缓解动物脑组织的病理变化,且TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α的分泌均低于正常对照组(P<0.01)。结论:柯里拉京能明显抑制小鼠小胶质细胞内TLR3通路达到缓解单纯疱疹病毒1型引起的脑组织的损伤。

C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A联合Toll样受体蛋白4检测在儿童肾病中的表达变化及相关性研究

目的:探讨C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)和Toll样受体蛋白4(TLR4)在儿童肾病中的表达变化,分析其联合检测的相关性和临床意义。方法:70例儿童肾病患儿为观察组,观察组43例单纯型肾病为单纯组,27例肾炎型肾病为肾炎组,30例健康体检患儿为对照组,免疫比浊法测定CRP和SAA水平,免疫组织化法测定TLR4表达,并进行相关性分析。结果:观察组CRP、SAA水平显著高于对照组,TLR4阳性表达率显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。单纯组的CRP、SAA和TLR4水平显著低于肾炎组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。CRP表达水平与SAA和TLR4水平呈正相关(r=0.712、0.824),SAA表达水平与TLR4水平呈正相关(r=0.731),差异有统计学意义(均P<0.05)。CRP、SAA与TLR4水平与年龄、性别无关(P>0.05),与疾病类型、病理学分类、合并感染等密切相关(均P<0.05)。CRP、SAA和TLR4联合检测的曲线下面积、灵敏度和特异度均高于CRP、SAA、TLR4单纯检测,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:儿童肾病患儿CRP、SAA和TLR4显著升高,且肾炎型肾病高于单纯型肾病患儿,CRP、SAA与TLR4存在相关性,联合诊断单纯型和肾炎型儿童肾病的价值高于单独诊断。

右美托咪啶对肾缺血再灌注损伤大鼠肾功能及肺组织Toll样受体4蛋白表达的影响

目的研究右美托咪啶(Dex)对肾缺血再灌注损伤(RIRI)大鼠肾功能及肺组织Toll样受体(TLR)4蛋白的影响。方法选择80只体重为250～300 g的清洁级SD雄性大鼠,按照随机数字表法分成对照组、I/R组(缺血再灌注组)、预处理组(给予Dex预处理)及后处理组(给予Dex后处理),每组20只。对比各组大鼠肾功能指标、血清白细胞介素(IL)-6和IL-1β水平及肺组织TLR4蛋白表达水平,分析大鼠肺组织TLR4蛋白表达水平与肾功能及IL-6和IL-1β水平的相关性。结果 I/R组、预处理组及后处理组的血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平均明显高于对照组,而预处理组及后处理组Scr和BUN水平均明显低于I/R组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。I/R组、预处理组及后处理组的IL-6和IL-1β水平均分别明显高于对照组,而预处理组及后处理组IL-6和IL-1β水平均明显低于I/R组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。I/R组、预处理组及后处理组TLR4蛋白表达水平均明显高于对照组,而预处理组及后处理组TLR4蛋白表达水平均明显低于I/R组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Spearman相关性分析显示,大鼠肺组织TLR4蛋白表达水平与Scr、BUN、IL-6及IL-1β均呈正相关(均P<0.05)。结论 Dex对RIRI大鼠的肾功能和炎症水平有明显改善作用,并降低肺组织TLR4蛋白的表达,且肺组织TLR4蛋白的表达与肾功能及炎症指标紧密相关,临床可考虑将其作为新型监测靶点。

Toll样受体-4与胰腺癌侵袭和转移的关系

背景与目的:Toll样受体-4(Toll-like receptor-4,TLR4)与多种肿瘤的侵袭和转移密切相关,然而其机制尚未阐明。本研究旨在探讨TLR4与胰腺癌侵袭和转移的关系,并分析其相关机制。方法:采用免疫组化法检测59例胰腺癌手术切除标本及30例癌旁正常胰腺组织中TLR4、基质金属蛋白酶-9蛋白(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)表达,分析TLR4、MMP-9蛋白表达与胰腺癌主要临床病理参数以及TLR4、MMP-9之间的相关性。以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用于体外培养的人胰腺癌细胞株PANC-1,通过Transwell小室检测细胞侵袭力,蛋白质印迹法(Western blot)检测MMP-9蛋白表达。结果:胰腺癌组织TLR4、MMP-9蛋白阳性表达率分别为72.9%和69.5%,均显著高于正常胰腺组织(P<0.01)。TLR4蛋白表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移密切相关,MMP-9蛋白与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05)。Spearman等级相关分析表明,TLR4表达与MMP-9表达呈显著正相关(P<0.01)。经LPS作用后,PANC-1细胞的侵袭数目较正常组显著增加(P<0.01)。经LPS作用6、12和24 h后,PANC-1细胞MMP-9蛋白的相对表达量均显著高于正常组(P<0.01)。结论:TLR4蛋白表达与胰腺癌的侵袭和转移密切相关,其机制可能与促进MMP-9蛋白表达有关。

炎症因子和TOLL样受体4重组蛋白及内皮缩血管肽-1在冠状动脉性心脏病患者中的表达与经皮冠状动脉介入治疗术后支架内再狭窄的相关性分析

目的探讨炎症因子、TOLL样受体4重组蛋白(TLR4)及内皮缩血管肽-1(ET-1)在冠状动脉性心脏病患者中的表达与经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后支架内再狭窄的相关性。方法回顾性分析2019年5月至2020年5月于本院行PCI术的48例冠状动脉性心脏病患者的临床资料,根据术后是否出现支架内再狭窄(ISR)分为ISR组(n=20)和非ISR组(n=28),比较两组血清白细胞介素-18(IL-18)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、ET-1及TLR4表达水平,采用多元logistic线性回归分析上述指标在冠状动脉性心脏病患者中的表达与PCI术后支架内再狭窄的相关性。结果治疗6个月后,非ISR组血清IL-18、hs-CRP、ET-1及TLR4表达水平均低于ISR组,差异有统计学意义(P<0.05);多元Logistic线性回归分析结果显示,hs-CRP、TLR4均为ISR的独立影响因素(P<0.05)。结论PCI术后联合检测hs-CRP、TLR4水平对冠状动脉性心脏病患者PCI术后发生ISR具有一定的预测价值。

培哚普利对心肌缺血再灌注损伤早期Toll样受体4表达的影响

目的观察培哚普利对缺血再灌注早期Toll样受体4蛋白(TLR4)的影响,初步探讨其对心肌缺血再灌注损伤的保护机制。方法30只Wistar大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组及培哚普利组。培哚普利组灌服培哚普利4mg/kg,每日1次,共7d。结扎大鼠左冠状动脉前降支(LAD),建立大鼠缺血再灌注模型,光镜观察心肌形态学改变,TUNEL法检测细胞凋亡数及免疫组化检测心肌组织中TLR4表达情况。结果与缺血再灌注组相比,培哚普利组炎症损伤减轻;培哚普利组心肌细胞凋亡数明显低于缺血再灌注组,但高于假手术组(P<0.05);培哚普利组心肌组织TLR4表达低于缺血再灌注组,但高于假手术组(P<0.05)。结论培哚普利可减轻心肌缺血再灌注早期的细胞凋亡,其机制之一可能是通过抑制TLR4所介导的炎症反应实现的。

Toll样受体蛋白4对大鼠液压冲击脑损伤炎性因子的调控作用

目的 观察液压冲击脑损伤大鼠Toll样受体蛋白4（TLR4）与炎性细胞因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达变化,探讨TLR4对炎性因子的调控作用.方法 成年雄性SD大鼠48只,制作液压冲击颅脑损伤模型,术后6、12、24 h、3、7d断头处死,用干湿重法、免疫织化法分别测定水肿脑组织含水量及其TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α表达.结果 创伤性颅脑损伤（TBI）组大鼠脑含水量从6h开始增加[（78.86 ±0.54）％],24 h时达到最大值[（83.07±0.27）％],持续至3d开始下降[（81.85±1.26）％];免疫组织化学显示水肿脑组织TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α的表达均在6h时开始增高（1.50±0.58、3.75±0.48、3.50±0.58、5.75 ±2.36）,在12h或24 h时达到高峰（5.50±1.00、7.80±1.64、7.75±1.05、7.50±1.73）,7d后降低.线性相关分析显示TLR4表达与IL-1β、IL-6、TNF-α表达呈正相关（r=0.941、0.907、0.836,P＜0.05）.结论 大鼠颅脑液压冲击伤TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α均出现高表达,TLR4可能通过调控炎性因子介导继发性脑损伤.

日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白 基因的克隆 表达及鉴定

目的克隆、表达日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白(SjTollip)基因,并研究该基因在日本血吸虫各虫期的转录表达情况。方法从日本血吸虫cDNA文库中挑出Toll样受体相互作用蛋白基因进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA和重组SjTollip蛋白免疫新西兰白兔的免疫兔血清,利用RT-PCR和蛋白质免疫印迹分析SjTollip基因在日本血吸虫各期转录表达的差异及重组SjTollip蛋白的免疫原性。结果构建了重组原核表达载体SjTollip/pET-28a,诱导获得以包涵体形式表达的不可溶重组蛋白,相对分子质量约为24000,与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白rSjTollip可被日本血吸虫感染兔血清识别。虫期转录特异性分析显示,该基因在尾蚴和雄虫中转录水平较低。免疫印迹分析结果显示,在虫卵、尾蚴、童虫、雄虫、雌虫各发育阶段都检测到该蛋白,但童虫和雌虫中表达水平明显升高。结论 SjTollip基因在日本血吸虫各发育阶段转录表达水平有较大差异,其有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。

柞蚕免疫系统相关基因ApTOLL1的克隆及两种蚕微孢子虫感染下的诱导表达

[目的]鉴定柞蚕的免疫相关TOLL样受体家族基因,以期为进一步探讨柞蚕的免疫机制奠定基础。[方法]克隆了柞蚕免疫系统相关TOLL样受体家族基因,并进行序列和系统进化分析,同时,利用两种蚕微孢子虫侵染柞蚕,检测TOLL样受体相关基因的表达差异,分析不同病原微孢子虫感染柞蚕后所引起的免疫应激差异。[结果]通过cDNA克隆测序获得一个可能与柞蚕免疫相关的基因片段,序列及系统进化分析显示它与家蚕Toll信号通路中的Toll1基因最为同源,将其命名ApTOLL1基因。进一步对柞蚕蛹分别注射家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫后,通过实时荧光定量PCR技术分析显示,注射家蚕微孢子虫2 h后蚕蛹内ApTOLL1大量表达,而注射柞蚕微孢子虫11 h后蛹内该基因才开始表达,这表明柞蚕Toll信号通路针对不同病原微孢子所诱导产生的免疫响应时间有所差异。[结论]该研究结果首次克隆了柞蚕ApTOLL1基因,并为进一步研究柞蚕的免疫机制提供了帮助。

基于心肌缺血状态的脑心通方对于心、脑组织Toll样受体相关通路蛋白的影响

目的:探讨心肌缺血状态下脑心通方对于心、脑组织中Toll样受体(TLR)相关通路蛋白的影响,以期揭示心肌缺血状态下脑心通方对心、脑作用的特点。方法:将雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、给药组和阳性药组。模型组、给药组和阳性药组分别采用结扎左冠状动脉主干支的方法复制心肌缺血模型,正常组只穿线不结扎。用多功能生理信号采集处理系统采集心电图;测定血液中的心肌酶谱数据;干湿重法检测脑水肿情况。Western blot检测大鼠心脏、大脑皮层的Toll样受体相关蛋白α干扰素(IFN-α)、干扰素调节因子(IRF)3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。结果:给药后大鼠紊乱的心电图趋于稳定;血液中心肌酶谱天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶含量和大鼠的脑含水量显著降低(P<0.05);免疫印迹结果表明脑心通方对心脏和大脑皮层中的IFN-α、IRF3、TLR2、TLR7、TLR9和TNF-α的表达都有显著的抑制作用(P<0.05,P<0.01)。结论:心肌缺血对脑的相关功能有一定影响,脑心通方对心肌缺血状态下的心和脑具有一定的干预作用。

儿童原发性肾病综合征Toll样受体相关蛋白表达的相关性研究

目的分析儿童原发性肾病综合征(PNS)患者Toll样受体相关蛋白TLR4和TLR7表达水平与肾损伤标记物和炎性因子的相关性,明确其临床价值。方法以宁波市北仑区人民医院2013年6月—2016年1月收治的92例儿童PNS患者为观察组,以37例健康肾脏组织为对照组,采用免疫组织化学实验测定组织TLR4和TLR7表达水平。根据TLR4和TLR7表达水平,进一步将患儿分为TLR4和TLR7表达均低于中位数组(A组,33例),TLR4和TLR7表达有一种低于中位数组(B组,29例),TLR4和TLR7表达均高于中位数组(C组,30例),采用全自动化学分析仪和ELISA试剂盒测定各组患儿外周血炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α水平,尿液肾损伤标记物NGAL、KIM-1水平。结果观察组患儿肾组织TLR4和TLR7的表达水平明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组之间NGAL、KIM-1水平不同,C组高于B组,B组高于A组,组间差异均有统计学意义(均P<0.05);Pearson相关性分析结果显示TLR4和TLR7表达水平均与尿液KIM-1水平呈正相关性(R^2=0.627、0.682,P<0.05)。各组之间IL-1β、IL-6及TNF-α水平不同,C组高于B组,B组高于A组,组间差异均有统计学意义(P<0.05);Pearson相关性分析结果显示TLR4和TLR7水平均与血清IL-6及TNF-α水平呈正相关性(R^2=0.586~0.655,P<0.05)。结论 PNS患儿TLR4和TLR7表达水平与肾损伤程度及炎性反应程度密切相关,具有不可忽视的临床价值。

穴位注射通过Toll样受体4/激活蛋白-1信号通路纠正Th1/Th2细胞因子失衡改善变应性鼻炎大鼠炎性反应

目的:观察穴位注射对变应性鼻炎(AR)大鼠血清辅助性T细胞(Th)1/Th2相关细胞因子及鼻黏膜Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、激活蛋白-1(AP-1)表达水平的影响,探讨穴位注射治疗AR的作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、非经非穴组、穴位注射组,每组8只。用卵清蛋白致敏法建立AR大鼠模型。穴位注射组给予地塞米松和利多卡因混合液注射双侧“迎香”和“印堂”,非经非穴组给予地塞米松和利多卡因混合液注射非经非穴处,两组均每4日治疗1次,共4次。对各组大鼠症状积分进行评定;HE染色法观察鼻黏膜组织病理形态学变化;ELISA法检测血清免疫球蛋白E(IgE)、白细胞介素(IL)-4和干扰素(IFN)-γ含量;免疫荧光染色法检测鼻黏膜组织TLR4、MyD88的表达;Western blot法检测鼻黏膜组织AP-1的表达。结果:与正常组比较,模型组症状积分显著升高(P<0.01),血清IgE、IL-4含量及鼻黏膜TLR4、MyD88、AP-1表达均显著升高(P<0.01),血清IFN-γ含量显著降低(P<0.01)。与模型组和非经非穴组比较,穴位注射组症状积分显著降低(P<0.01),血清IgE、IL-4含量及鼻黏膜TLR4、MyD88、AP-1表达均显著降低(P<0.01,P<0.05),血清IFN-γ含量显著升高(P<0.01)。模型组和非经非穴组可见鼻黏膜上皮大部分脱落,固有层血管扩张,腺体增生,伴有嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润;穴位注射组上皮病变、腺体增生和炎性反应明显减轻。结论:穴位注射可有效改善AR大鼠鼻部过敏性炎性反应,其机制可能与抑制炎性信号通路TLR4/AP-1的异常激活,进而调节Th1/Th2细胞平衡有关。