免疫系统中丝氨酸蛋白酶的研究进展

动物的免疫防御可以通过补体系统、酚氧化酶原激活系统,及血淋巴凝结和抗菌肽合成等途径识别异物,发挥调理作用,直接将病原体杀死并排出体外。目前研究发现,丝氨酸蛋白酶在这些途径中起着非常关键的作用,它通常是通过一系列的酶促级联反应来发挥作用的,本文就参与这些途径的一些丝氨酸蛋白酶的种类、结构和功能在近几年的研究进展作一综述,以期为进一步研究提供参考。

小儿脓毒症Toll样受体信号途径转导分子及调节因子的变化研究

目的探讨Toll样受体（TLRs）信号途径转导分子及调节因子在小儿脓毒症异常炎症免疫反应发病机制中的可能作用。方法选择脓毒症患儿10例、严重脓毒症患儿13例及同期健康体检儿童17例。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real—time PCR）检测前炎症细胞因子[肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）]，以及TLRs信号途径转导分子和调节因子的mRNA表达；采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测前炎症细胞因子蛋白水平。结果与健康对照组比较，脓毒症组TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表达均增加，TLRs信号途径转导分子TLR2、TLR4、髓样细胞分化蛋白-88（MyD88）、TNF相关因子6（TRAF6）、IL-1受体相关激酶4（IRAK4）、转化生长因子-β活化激酶1（TAK1）、TAK1结合蛋白2（TAB2）的mRNA表达以及TLRs信号途径正性调节因子TLR4相关蛋白（PRAT4B）、信号转换接头蛋白2（STAP2）的mRNA表达均明显增高（P均〈0．01），且严重脓毒症组较脓毒症组升高更显著（P均〈0．01）。脓毒症组TLRs信号途径负性调节因子IL-1受体相关激酶3（IRAK—M）、核转录因子-κB抑制性锌指蛋白（Triad3A）的mRNA表达均明显增高（P均〈0．01），严重脓毒症组表达则明显低于脓毒症组（P均〈0．01）。结论TLRs信号途径转导分子／调节因子异常表达可能是脓毒症时全身炎症反应的原因之一。

昆虫病原线虫Heterorhabditidoides rugaoensis及其共生菌Serratianema todiphila R187与黒腹果蝇免疫系统的互作研究

[目的]本研究通过Heterorhabditidoides rugaoensis/Serratia nematodiphila R187侵染黑腹果蝇的免疫突变体,来研究该类昆虫病原线虫/共生菌成功侵染果蝇成虫的相关机制。[方法]分别利用携带共生菌的线虫侵染、钨针沾共生菌菌悬液针刺和人工饲喂共生菌3种方法将S.nematodiphila R187植入果蝇血腔或肠道;通过果蝇死亡率、细菌菌落计数,结合果蝇体液免疫信号系统调控的2种抗菌肽——Diptericin和Drosomycin表达的Q-PCR检测,研究H.rugaoensis-S.nematodiphila R187与果蝇体液免疫系统的互作。[结果]H.rugaoensis携带共生菌和共生菌针刺侵染后同时激活果蝇的Toll和Imd途径;荧光定量PCR结果显示侵染过程中Diptericin和Drosomycin的相对表达均呈先上升再逐渐减弱的趋势;共生菌侵入果蝇血腔后,FADD突变体的Drosomycin相对表达量在6 h达到最高(100%),Dif突变体和野生型的Diptericin的相对表达量在12 h达到最高(90%)。共生菌侵染果蝇肠道时,仅在18 h时检测到抗菌肽的微弱表达。3种侵染方法均可导致果蝇死亡;Dif突变体果蝇和野生型果蝇的死亡进程相似,略慢于FADD突变体;以共生菌针刺侵染的致病力最强,20 h果蝇全部死亡。[结论]S.nematodiphila R187侵染果蝇时,Toll途径和Imd途径都被激活;果蝇抵抗S.nematodiphila R187入侵的体液免疫信号通路主要是其Imd途径;S.nematodiphila R187可能采用免疫逃避机制从其肠道成功侵染果蝇。

苦参碱经TLR4/NF-κB通路对膀胱癌小鼠免疫机制的调控作用

目的:探究苦参碱通过Toll样受体4(TLR4)/核因子(NF)-κB通路对膀胱癌小鼠免疫机制的调控作用。方法:通过皮下注射膀胱癌细胞系T24的方法构建膀胱癌小鼠模型。将36只模型小鼠随机分为对照组、苦参碱低剂量组和苦参碱高剂量组(n=12)。苦参碱腹腔注射干预,剂量分别为5、10 mg·kg^(-1)。测量肿瘤生长情况,采用蛋白质印迹法检测增殖相关蛋白细胞周期蛋白D1(CyclinD1)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达,TUNEL染色检测细胞凋亡。比较各组TLR4/NF-κB通路的转录和翻译水平。采用流式细胞术检测各组CD4^(+)、CD8^(+)细胞百分比,免疫组化染色检测肿瘤组织中CD4^(+)细胞浸润情况。结果:3组小鼠各项指标比较差异均有统计学意义(P<0.05)。苦参碱低剂量组和苦参碱高剂量组的肿瘤体积、质量,Cyclin D1和PCNA蛋白表达水平,TLR4、NF-κB mRNA及蛋白表达水平均显著低于对照组,凋亡指数均显著高于对照组(P<0.05);苦参碱高剂量组的肿瘤体积、质量,Cyclin D1和PCNA蛋白表达水平,TLR4、NF-κB mRNA及蛋白表达水平均显著低于苦参碱低剂量组,凋亡指数显著高于苦参碱低剂量组(P<0.05)。3组小鼠的CD4^(+)细胞百分比、CD4^(+)/CD8^(+)和CD4^(+)细胞浸润情况比较差异有统计学意义(P<0.05)。苦参碱低剂量组和苦参碱高剂量组的CD4^(+)细胞百分比、CD4^(+)/CD8^(+)、CD4^(+)细胞浸润水平均显著高于对照组(P<0.05);苦参碱高剂量组的CD4^(+)细胞百分比、CD4^(+)/CD8^(+)、CD4^(+)细胞浸润水平均显著高于苦参碱低剂量组(P<0.05)。结论:苦参碱可能通过调控TLR4/NF-κB途径抑制膀胱癌小鼠模型的肿瘤生长和诱导凋亡,并提高CD4^(+)/CD8^(+)水平促进CD4^(+)细胞的浸润。

海珠益肝加味方对慢性免疫性肝损伤小鼠LPS/TLR4信号途径的影响

目的:研究海珠益肝加味方对刀豆蛋白(Con A)诱导的慢性免疫肝损伤小鼠脂多糖/Toll样受体4(LPS/TLR4)信号途径的影响。方法:C57BL/6小鼠48只,随机均分为4组,空白对照组、模型组、甘草酸二铵组、海珠益肝加味方组,采用尾静脉Con A注射法复制模型。造模成功后,空白对照组、模型组予20m L/kg蒸馏水灌胃,甘草酸二铵组予甘草酸二铵0.68mg·kg-1·d-1灌胃,海珠益肝加味方组予海珠益肝加味方15.17g·kg-1·d-1灌胃。干预4周后,采集血清检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBi L);鲎试剂显色基质法测定脂多糖(LPS);ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6);Western Blot检测肝脏组织TLR4,My D88,核因子-κB(NF-κB)蛋白表达。结果:与模型组比较,海珠益肝加味方组小鼠ALT、AST、TBi L水平显著下降(P<0.05,P<0.01);与模型组和甘草酸二铵组比较,海珠益肝加味方干预组LPS水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,海珠益肝加味方干预组TNF-α、IL-6水平均明显下降(P<0.05);与模型组和甘草酸二铵组比较,海珠益肝加味方组小鼠肝组织TLR4、My D88、NF-κB的蛋白表达显著下调(P<0.05,P<0.01)。结论:海珠益肝加味方保护肝脏的作用机制与抑制TLR4-My D88-NF-κB信号通路有关。

IL-13对IRAK-M敲除哮喘小鼠TLR/IL-1R途径及巨噬细胞活化的影响

目的探讨白介素(IL)-13对IL-1受体相关激酶M(IRAK-M)敲除哮喘小鼠巨噬细胞活化及Toll样受体/白介素1受体(TLR/IL-1R)途径的影响。方法实验分组:对照组、IRAK-M敲除组、哮喘组、IRAK-M敲除+哮喘组、哮喘+抗IL-13抗体组、IRAK-M敲除+哮喘+抗IL-13抗体组。收集肺泡灌洗液(BALF)并对细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞计数;酶联免疫吸附(ELISA)检测BALF中IL-13、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-4表达水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肺组织中甘露糖受体(MR)、精氨酸酶1(Arg1)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)mRNA水平;蛋白免疫印迹检测肺组织中IRAK-M、IL-13、TLR4、核转录因子kappaB(NF-κB)蛋白水平。结果与对照组相比,哮喘组各细胞数,BALF中IL-13、IL-4水平,肺组织中MR、Arg1、iNOS mRNA水平及IL-13、IRAK-M、TLR4、胞核NF-κB蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);BALF中IFN-γ水平,肺组织中胞浆NF-κB蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。分别与IRAK-M敲除+哮喘组、哮喘+抗IL-13抗体组相比,IRAK-M敲除+哮喘+抗IL-13抗体组各细胞数,BALF中IL-13、IL-4水平,肺组织中MR、Arg1、iNOS mRNA水平及IL-13、IRAK-M、TLR4、胞核NF-κB蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);BALF中IFN-γ水平,肺组织中胞浆NF-κB蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论抗IL-13抗体与IRAK-M敲除功能类似,均可缓解哮喘小鼠巨噬细胞活化状况。