保肾通络方抑制DN小鼠肾小球炎症和系膜基质增生减轻肾脏损伤机制研究

[目的]探讨保肾通络方对于糖尿病肾病(DN)小鼠肾小球炎症及系膜基质增生的影响。[方法]KK-Ay小鼠高脂喂养4周建立DN小鼠模型。造模成功的KK-Ay小鼠随机分为模型组、保肾通络方组及缬沙坦组,另外选取C57BL/6J小鼠作为正常对照组。保肾通络方组予保肾通络方灌胃,缬沙坦组予缬沙坦灌胃,模型组及正常对照组予等剂量的蒸馏水灌胃。连续灌胃12周。在灌胃0、4、8和12周收集24 h尿液检测尿蛋白水平。灌胃12周后心尖取血检测血肌酐及尿素氮水平。苏木精-伊红(HE)、糖原(PAS)、Masson染色观察肾脏病理改变,免疫组化检测各组小鼠肾小球Ⅳ型胶原蛋白(CollagenⅣ)及纤连蛋白(FN)表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组小鼠肾小球CollagenⅣ及FN的mRNA表达水平,酶联免疫法检测各组小鼠肾组织中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。[结果]与正常对照组相比,模型组小鼠24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平明显升高(P<0.05);肾小球系膜细胞增多,细胞外基质增生;肾小球基质蛋白CollagenⅣ及FN蛋白和mRNA表达明显上调(P<0.05);肾组织TNF-α和IL-6水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比,保肾通络方及缬沙坦组小鼠24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平明显降低(P<0.05);肾小球系膜细胞增多及细胞外基质增生明显减轻;肾小球细胞外基质蛋白CollagenⅣ及FN蛋白和mRNA表达明显下调(P<0.05);肾组织TNF-α和IL-6水平明显下降(P<0.05)。[结论]保肾通络方能够降低DN小鼠蛋白尿,改善肾功能,并且能够抑制肾小球炎症和系膜基质增生,减轻肾脏病理损伤。

保肾通络方对KK-Ay小鼠足细胞p38通路及凋亡的作用机制研究

目的探讨保肾通络方对KK-Ay小鼠肾脏足细胞p38通路及凋亡的影响,进而阐明保肾通络方防治DN的分子机制。方法30只KK-Ay小鼠随机分为模型组、保肾通络方组及缬沙坦组,另选取10只C57BL/6J小鼠作为正常对照组。保肾通络方组和缬沙坦组分别给予保肾通络方和缬沙坦灌胃,正常对照组和模型组予等剂量蒸馏水灌胃,实验周期为12周。结果与正常对照组相比,模型组足细胞p38通路显著激活,足细胞凋亡数目明显增加(P<0.05);与模型组相比,保肾通络方组及缬沙坦组小鼠足细胞p38通路激活被抑制,足细胞凋亡数目明显减少(P<0.05)。结论保肾通络方可以抑制DN小鼠足细胞p38通路激活,减轻足细胞凋亡,可能是其降低DN蛋白尿,延缓疾病进展的分子机制。

保肾通络方联合缬沙坦胶囊治疗糖尿病肾病临床研究

目的探讨保肾通络方联合缬沙坦胶囊在治疗糖尿病肾病患者中的应用及对患者肾功能的影响。方法将200例糖尿病肾病患者随机分为观察组和对照组,各100例。2组均进行基础降糖、降压、降脂治疗,对照组予缬沙坦治疗,观察组联合保肾通络方治疗。连续治疗2个月后观察2组临床疗效、中医证候积分、炎性因子水平、肾功能指标、不良反应发生率。结果观察组总有效率为89.00%(89/100),高于对照组为77.00%(77/100)(P<0.05)。治疗后,观察组疲乏无力、浮肿、面色晦暗、夜尿频数等中医证候积分评分均低于对照组(P<0.05),炎性因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)均低于对照组(P<0.05),肾功能指标尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿蛋白排泄率(UAE)、β2-微球蛋白(β2-MG)水平均低于对照组(P<0.05),MAP水平低于对照组(P<0.05)。2组不良反应发生情况比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论保肾通络方联合缬沙坦胶囊治疗糖尿病肾病患者,能够改善患者的各项症状,降低中医证候积分、炎性因子水平,改善患者的肾功能指标,且治疗安全性良好。

基于AMPK/mTOR/ULK1通路探讨解毒通络保肾方改善糖尿病肾脏疾病的作用机制

目的通过动物实验及细胞实验观察解毒通络保肾方对糖尿病肾脏疾病(DKD)大鼠肾脏病理形态及大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)增殖的影响,探讨其改善DKD的作用机制。方法(1)从85只健康雄性SD大鼠中任取10只纳入正常组,其余大鼠采用高脂饲料喂养与链脲佐菌素注射诱导为DKD模型。造模成功的大鼠按体质量随机分为模型组,厄贝沙坦组(16 mg/kg),解毒通络保肾方低、中、高剂量组(0.5、1.0、2.0 g/kg)。正常组及模型组给予等量生理盐水灌胃。每日1次,连续灌胃8周。采用光学显微镜和透射电镜观察肾脏组织病理形态,蛋白质印迹法检测肾脏组织自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin-1)、自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)、泛素结合蛋白P62(P62)、自噬相关蛋白5(ATG5)的表达。(2)培养HBZY-1细胞,分为空白对照组(5.5 mmol/L葡萄糖),模型组(30 mmol/L葡萄糖),解毒通络保肾方低、中、高剂量组(50、100、200 mg/L),厄贝沙坦组(5μmol/L)。采用CCK8法检测细胞增殖率,划痕实验检测细胞迁移能力,蛋白质印迹法检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、ATG5与腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、unc-51样激酶1(ULK1)及磷酸化蛋白(p-ULK1、p-AMPK及p-mTOR)的表达。结果(1)解毒通络保肾方可改善DKD大鼠肾脏基底膜、系膜、肾小管上皮细胞病理形态与超微结构,增加自噬小体、自噬溶酶体数量。与正常组比较,模型组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5蛋白表达降低,P62蛋白表达增加(P<0.01);解毒通络保肾方干预后,肾组织中Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5蛋白表达增加,P62蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。(2)解毒通络保肾方可抑制高糖诱导的HBZY-1细胞增殖,增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5、p-ULK1、p-AMPK蛋白表达,降低P62、p-mTOR蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论解毒通络保肾方可改善DKD大鼠肾脏组织病理与超微结构,抑制高糖诱导的HBZY-1细胞增殖,其机制可能是通过调控AMPK/mTOR/ULK1通路,改善细胞自噬实现的。

通络保肾复方对糖尿病大鼠肾脏内质网应激介导的凋亡信号通路JNK、Caspase-12的影响

目的:探讨通络保肾复方及其拆方对糖尿病大鼠肾损伤内质网应激凋亡通路的影响。方法:将SD大鼠随机分成正常组、造模组,腹腔注射STZ建造糖尿病大鼠模型,造模成功后随机分成模型组、缬沙坦组、通络保肾复方组、中药通络保肾补虚组、中药通络保肾解毒组。喂养6周后测大鼠血糖(GLU)、糖化血红蛋白(Hb A1c)、血浆白蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)及肾组织GRP78、p-JNK、Caspase-12蛋白及基因的表达。结果:6周时与正常组比较,模型组GLU、HbA1c、BUN升高(P<0.01);与模型组比较,缬沙坦组GLU、HbA1c、BUN下降(P<0.01);各中药治疗组HbA1c下降(P<0.01)。Western blot、qRT-PCR结果:与正常组比较,模型组大鼠GRP78、p-JNK表达上调(P<0.01);与模型组比较,各治疗组表达下调(P<0.01,P<0.05)。结论:通络保肾复方及其拆方可抑制内质网应激诱导JNK凋亡通路激活,6周时无Caspase-12信号激活。结合中医学方证理论,以方测证,推测糖尿病肾损伤的中医核心病机为本虚标实。