温肾通络止痛方对小鼠H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响

背景:骨骼依赖血管与骨细胞之间的密切连接来维持完整性,骨骼处在生理低氧环境中,因此在低氧环境下研究血管生成与骨生成具有重要意义。目的:探究在低氧环境下温肾通络止痛方对H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响及相关机制。方法:运用酶消化法及流式分选技术,分选小鼠H型血管特异型骨微血管内皮细胞;应用骨髓贴壁法分离获取小鼠骨髓间充质干细胞;采用Transwell小室以及缺氧培养工作站建立两种细胞低氧共培养体系,使用50,100μg/m L质量浓度温肾通络止痛方冻干粉进行干预;通过划痕迁移实验与管形成实验评估共培养体系内H型骨微血管内皮细胞的成血管功能;通过碱性磷酸酶染色与茜素红染色评估共培养体系内骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;使用Western Blotting与q-PCR检测共培养体系内H型骨微血管内皮细胞中PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白表达及mRNA表达。结果与结论:(1)与常氧组相比,低氧组H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度均显著升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强(P<0.05);PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达升高(P<0.05);(2)与低氧组相比,经不同质量浓度温肾通络止痛方干预后H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度进一步提高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强(P<0.05),PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达也进一步升高(P<0.05)。结果表明:低氧条件下H型血管生成及骨生成可能与PDGF/PI3K/AKT信号轴有关,而温肾通络止痛方可能通过激活PDGF/PI3K/AKT信号轴促进“H型血管生成-骨生成”作用从而防治骨质疏松症。

通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎症细胞上清IL-1β及TNF-α的影响

目的:观察通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎症细胞上清白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的影响。方法:取本院行全膝关节置换术患者术中废弃滑膜组织,经I型胶原酶消化后进行细胞培养,取上清液,加入不同浓度通络止痛方干预,分为:(1)高浓度组:2.5 mg/m L;(2)中浓度组:0.25 mg/m L;(3)低浓度组:0.025 mg/m L;(4)对照组:0 mg/m L。应用酶联免疫吸附法检测观察各浓度组对上清液干预后IL-1β及TNF-α的浓度。结果:高中低浓度组较对照组上清液中IL-1β及TNF-α含量明显降低(P<0.05),且下降的幅度与通络止痛方的浓度呈正相关(IL-1β:r=0.38,P<0.05;TNF-α:r=0.41,P<0.05)。IL-1β及TNF-α的高浓度组达到抑制高峰,与中、低浓度组比较,差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论:通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎症细胞上清IL-1β及TNF-α有抑制作用,随浓度增高,抑制程度越明显。

基于网络药理学及体内实验探讨温肾通络止痛方对原发性骨质疏松症小鼠MAPK信号通路的调节作用

目的:采用网络药理学和体内实验验证的方法探讨温肾通络止痛方治疗原发性骨质疏松症的潜在作用机制。方法:选择TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM与OMIM、GeneCards数据库筛选温肾通络止痛方治疗原发性骨质疏松症的有效活性成分及靶标基因;利用Cytoscape 3.7.2建立其网络关系图;通过STRING在线分析平台构建PPI网络并运用NetworkAnalyzer拓扑学分析进一步筛选核心靶点;借助DAVID进行GO和KEGG富集分析,筛选具有统计学差异的GO过程与KEGG通路(P<0.05)。以去卵巢的方式建立原发性骨质疏松症模型,21只SPF级C57BL/6J雌性小鼠随机分为假手术组、模型组、温肾通络止痛方组,假手术组切除卵巢周围相等质量的脂肪组织,模型组和温肾通络止痛方组切除双侧卵巢;灌胃相应药物8周后,苏木素-伊红(HE)染色观察股骨组织形态学变化,酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠血清IL-6、TNF-α的表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)检测IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA的表达水平,蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测p-ERK、ERK、p-JNK、JNK的蛋白表达。结果:网络药理学方法筛选出温肾通络止痛方防治原发性骨质疏松症的有效活性成分包括山柰酚、槲皮素、木犀草素等203个,靶标基因包括IL-6、TNF-α、MAPK8等154个。KEGG富集分析预测温肾通络止痛方主要通过PI3K/Akt、TNF、MAPK等信号通路发挥抗骨质疏松作用。HE染色结果显示,与假手术组比较,模型组小鼠骨小梁稀疏,骨髓腔间隙较大,温肾通络止痛方可改善模型小鼠骨小梁密度,减小骨髓腔间隙。与模型组比较,温肾通络止痛方能够降低模型小鼠血清中IL-6、TNF-α的表达水平(P<0.01),降低IL-6、TNF-αmRNA表达(P<0.01),升高Runx2的mRNA的表达(P<0.01),并同时降低p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:温肾通络止痛方治疗原发性骨质疏松症具有多成分、多靶点、多途径的特点,可能通过IL-6、TNF-α靶点调控MAPK信号通路影响炎症反应等来发挥防治原发性骨质疏松症的作用。

通络止痛凝胶制剂对膝骨关节炎大鼠的影响

目的:观察通络止痛凝胶制剂对膝骨关节炎(KOA)模型大鼠患膝直径、软骨形态及白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的影响,探讨通络止痛凝胶制剂治疗KOA的疗效及机制。方法:将48只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、中药组、西药组,每组12只。正常组不造模,其他3组采用改良Hulth法建立KOA模型。造模成功后,中药组、西药组分别外涂中药凝胶剂、扶他林乳膏,正常组、模型组分别涂以等剂量0.9%氯化钠溶液,3次/d,共2周。使用游标卡尺于不同时间点测量患膝直径,治疗结束后软骨组织切片采用番红-固绿染色后光镜下观察软骨组织形态,血清采用ELISA法、滑膜组织采用Western Blot法检测IL-1β、TNF-α、MMP-13的含量。结果:与模型组比较,治疗1周后中药组、西药组的膝关节直径变小(P<0.05,P<0.01),治疗2周后中药组优于西药组(P<0.05);与模型组比较,中药组、西药组关节软骨表面较平整,结构层次较清晰,中药组稍优于西药组;与模型组比较,中药组、西药组血清和滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13的含量均显著降低(P<0.01,P<0.05);与西药组比较,中药组血清和滑膜组织中IL-1β、MMP-13的含量显著降低(P<0.05)。结论:通络止痛凝胶制剂治疗大鼠KOA安全有效,可以改善其软骨损伤并缓解滑膜炎症反应。

通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎性细胞TLR4、IL-1β及NO的影响

目的:观察通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎性细胞TLR4、IL-1β及NO的影响。方法:取本院行全膝关节置换术患者术中废弃滑膜组织培养成纤维细胞进行不同浓度浓度通络止痛方干预,具体分为:高浓度组(2.5mg/m L)、中浓度(0.25mg/m L)、低浓度组(0.025mg/m L)、对照组。应用PCR检测细胞内TLR4 m RNA表达情况,采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、NO浓度的变化。结果:高、中、低浓度组较对照组上清液中IL-1β及NO含量显著降低(P<0.05),且下降的幅度与通络止痛方的浓度呈正相关(1L-1β:r=0.39,P<0.05;NO:r=0.52,P<0.05)。与对照组比较,高、中浓度组TLR4 m RNA的表达水平显著降低(P<0.05)。低浓度组TLR4 m RNA抑制作用与对照组差异无统计学意义。中、高浓度组抑制作用与浓度呈正比。结论:提示通络止痛方可能通过Toll样受体通路影响或抑制人膝骨关节炎滑膜炎性反应。