基于血浆非靶向代谢组学和肠道菌群16S rRNA测序技术探讨养心通脉方干预冠心病血瘀证大鼠的作用机制

目的探讨肠道菌群和血浆代谢物与冠心病血瘀证的关联性,及养心通脉方干预冠心病血瘀证的作用机制。方法18只SPF级雄性SD大鼠建立冠心病血瘀证模型后,随机分为模型组、养心通脉方组和阿托伐他汀钙组,每组各6只,灌胃干预2周。另取6只一直正常饮食的大鼠作为正常对照组。苏木精-伊红染色法(HE)染色观察大鼠冠状动脉病理变化及检测心电图、血流变和血脂生化指标,液相色谱-串联质谱联用技术(LCMS/MS)技术分析大鼠血浆非靶向代谢组学,16S rRNA测序技术分析回肠黏膜菌群以及对两者代谢组学进行相关性分析。结果与正常组相比,模型组大鼠全血黏度、总胆固醇酯和低密度脂蛋白胆固醇酯均显著升高(P<0.05);模型组冠状动脉内皮细胞增生破坏,内皮下有大量空泡状改变,药物组冠状动脉内皮病变程度减轻。LCMS/MS结果共筛选鉴定出血清33种潜在内源性代谢物,其中1-甲基组氨酸、N-乙酰组胺、黄体酮和脱氧皮质酮可能成为冠心病血瘀证疾病模型的差异性代谢物,16S rRNA结果显示养心通脉方组肠道菌群的多样性和丰富度有所改善,通过相关性分析,与冠心病血瘀证高度相关的变形杆菌门Hydrogenophaga、Limnohabitans和Polaromonas菌属等与5-羟基吲哚、N-乙酰组胺和黄体酮等血浆代谢产物呈正相关(P<0.01),与L-精氨酸、高精氨酸和Boc-β-氰基-L-丙氨酸等血浆代谢产物呈负相关(P<0.01);经养心通脉方干预后与其高度相关的拟杆菌门(乳杆菌目)Lactobacillus菌属、泉古菌门Candidatus Nitrososphaera菌属及放线菌门Corynebacterium菌属与Boc-β-氰基-L-丙氨酸、水苏碱和柚皮素等血浆代谢产物呈正相关(P<0.05),与5-羟基吲哚、N-乙酰组胺和油酰单乙醇胺等呈负相关(P<0.05)。结论养心通脉方可能通过调节冠心病血瘀证大鼠肠道菌群改善血浆代谢,达到减缓冠心病血瘀证之目的。

通脉安神方加减治疗稳定型心绞痛合并睡眠障碍74例临床观察

目的 观察通脉安神方加减治疗稳定型心绞痛(SAP)合并睡眠障碍的临床疗效。方法 纳入148例SAP合并睡眠障碍患者,随机分为对照组和治疗组,每组74例。对照组给予西药常规治疗,治疗组在对照组的基础上加用通脉安神方加减治疗(每日1剂),两组均治疗4周。比较两组患者治疗前后心绞痛症状、中医证候、睡眠质量、生活质量以及血清学指标[包括血清细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1)、脑源性神经生长因子(BDNF)和酪氨酸激酶受体B (TrkB)]的变化情况,并进行安全性评价。结果 治疗组与对照组中医证候总有效率(82.43%vs 52.70%)、心绞痛总有效率(79.73%vs64.86%)、睡眠总有效率(89.19%vs 68.92%),差异均有统计学意义(P<0.01)。治疗后两组中医证候总积分、主症积分、次症积分(及次症中不寐、心烦、乏力与神疲积分)、心绞痛积分、匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)总分及各单项积分均较本组治疗前降低,SF-36各单项积分均较本组治疗前升高,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组治疗后中医证候总积分和主症积分、次症中单项(不寐、心烦、乏力和神疲)积分、心绞痛积分、入睡时间、睡眠质量、催眠药物、睡眠障碍、日间功能障碍积分和PSQI总分均明显低于对照组(P<0.05),而躯体疼痛、一般健康状况、社会功能、情感职能、精神健康和健康变化积分均明显高于对照组(P<0.05)。治疗后治疗组ICAM-1和VCAM-1水平均较治疗前明显降低(P<0.05),BDNF和TrkB水平升高(P<0.05);而对照组BDNF水平减低(P<0.05)。治疗组治疗后,TrkB较对照组明显升高(P<0.05)。治疗期间共发生不良事件4例,均判断为与本研究无关。结论 通脉安神方加减对SAP合并睡眠障碍患者心绞痛症状、中医证候、睡眠质量和生活质量均有显著改善,其机制可能与保护血管内皮功能和中枢神经元有关。

养心通脉方对心肌梗死血瘀证模型大鼠心肌能量代谢的影响

目的探讨养心通脉方治疗心肌梗死血瘀证的可能作用机制。方法50只大鼠随机选取38只在高脂饲料喂养下运用维生素D3灌胃+异丙肾上腺素腹部皮下注射的方法建立心肌梗死血瘀证模型。从造模成功的28只大鼠中选出24只随机分为模型组、养心通脉方组和阿托伐他汀钙组,每组8只,未进行造模的大鼠中8只作为空白组。养心通脉方组大鼠给予养心通脉方12 g/(kg·d)灌胃,阿托伐他汀钙组大鼠给予阿托伐他汀钙片1.8 mg/(kg·d)灌胃,空白组和模型组给予4 ml/(kg·d)蒸馏水灌胃,各组均每天1次,连续14天。HE染色法观察冠状动脉病理形态学改变,透射电镜观察心肌组织线粒体超微结构及数量变化,ELISA法检测心肌组织腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、血清一氧化氮(NO)与C1q肿瘤坏死因子相关蛋白3(CTRP3)水平,Western blot法测定心肌组织CTRP3蛋白表达水平。结果与空白组相比,模型组冠状动脉组织出现内膜增厚、内皮破损、炎性浸润等改变;心肌线粒体数量减少,膜结构变浅,部分破溃;心肌组织ATP、血清NO水平明显降低,心肌组织CTRP3蛋白表达及血清CTRP3水平明显下降(P<0.05)。与模型组比较,养心通脉方组和阿托伐他汀钙组冠状动脉内皮损伤情况均明显改善,心肌组织肌小节排列规律,心肌线粒体数量增加、结构完整,心肌组织ATP含量、血清NO含量显著升高,心肌组织CTRP3蛋白表达及血清CTRP3水平明显升高(P<0.05)。与养心通脉方组比较,阿托伐他汀钙组冠状动脉内皮损伤以及线粒体膜结构破坏成程度均较为明显,心肌组织ATP及CTRP3蛋白表达水平、血清CTRP3水平均明显升高(P<0.05)。结论养心通脉方能够显著改善心肌梗死血瘀证大鼠的心肌线粒体能量代谢功能,抵抗冠状动脉内皮损伤,其机制可能与升高脂肪因子CTRP3含量相关。

基于网络药理学与实验验证探讨益气通脉方治疗缺血性中风作用机制

目的:基于网络药理学、分子对接及动物实验验证探讨益气通脉方治疗缺血性中风的作用机制,旨在为其基础研究及临床应用提供依据。方法:经由TCMSP、ETCM、TCMID、BATMAN、SwissADME、SwissTargetPrediction数据库确定中药活性成分及作用靶点;于DisGeNET、DIGSEE、DRUGBANK、GeneCards、OMIM数据库筛选疾病相关靶点;通过STRING11.5数据库获得蛋白互作网络;采用Metascape数据库对靶点进行富集分析;Cytoscape 3.9.0软件分别构建“中药-成分-靶点”、“蛋白互作”、“成分-靶点-通路”网络图;采用SYBYL-X2.1.1及PYMOL软件进行分子对接研究。通过MCAO大鼠模型进行相关验证,采用mNSS评分法观察各组大鼠行为学变化,计算脑组织含水率,TTC染色、HE染色及TUNEL染色检测脑组织梗死率、神经细胞形态学变化与凋亡率,ELISA、Western Blot法检测脑组织相关蛋白表达。结果:通过网络药理学分析,预测益气通脉方主要活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、豆甾醇、等,可能通过IL-6、AKT1、VEGFA、MAPK3、TNF、JUN、IL-1β、TP53、等靶点,作用于IL-17、TNF、PI3K-AKT、MAPK、等信号通路从而治疗缺血性中风,分子对接结果显示,益气通脉方中潜在核心活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇,与主要靶点TNF、IL-6、IL-1β、VEGFA、MAPK3结合活性较强。动物实验方面,与假手术对照组比较,模型对照组大鼠mNSS评分、脑梗死率、脑含水率、细胞凋亡率、缺血区脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-18含量升高、NF-κBp65、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达显著上调(P<0.01);与模型对照组比较,除银杏叶片6.48 mg/kg组大鼠脑组织TNF-α、Caspase-1降低不明显,各药物组大鼠上述指标均明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:基于网络药理学预测、分子对接及动物实验验证等研究方法,发现益气通脉方可通过多组分、多靶点的特点,从抗炎、抗氧化、抗血栓、抗凋亡、等多通路途径发挥治疗缺血性中风的作用,干预NF-κB信号通路与NLRP3炎性小体轴可能是其主要作用机制之一。

温阳通脉方通过NRF2/HO-1通路对缺氧/复氧损伤H9c2心肌细胞氧化应激的保护作用

目的:基于核因子NF-E2相关因子2(NRF2)/血红素加氧酶-1(HO-1)信号通路探讨温阳通脉方含药血清保护H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)后氧化应激损伤机制。方法:制备大鼠的空白血清和温阳通脉方的含药血清,以H9c2心肌细胞为研究对象,用氯化钴(CoCl_(2))及新鲜培养基制备缺氧/复氧(H/R)模型。将细胞分为:空白对照组、模型对照组、13 g/kg温阳通脉方含药血清5%、10%、20%组。用CCK-8法检测细胞活性;比色法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)的活力或含量;DCFH-DA探针法检测细胞活性氧(ROS)的水平;Western blot法检测低氧诱导因子(HIF-1α)、核因子E2相关因子2(NRF2)、血红素加氧酶1(HO-1)的蛋白表达;Hoechst33342荧光染色法检测细胞凋亡率和形态学变化。结果:与空白对照组比较,模型对照组细胞活性明显降低,MDA、LDH含量、ROS水平明显增高,SOD活力明显降低(P<0.05);HIF-1α、NRF2、HO-1蛋白表达明显上调;核碎裂细胞增加,凋亡率明显增加(P<0.05);与模型对照组比较,温阳通脉方含药血清5%、10%、20%组均能明显改善缺氧/复氧损伤H9c2细胞活性,减少MDA、LDH含量(P<0.05),增加SOD活力(P<0.05),减少ROS含量,下调HIF-1α蛋白表达(P<0.05);不规则形态、核碎裂细胞和凋亡率减少(P<0.05);温阳通脉方20%含药血清组ROS水平、NRF2、HO-1蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论:温阳通脉方能减轻缺氧/复氧诱导的H9c2细胞氧化应激损伤,分子机制可能与调节NRF2/HO-1通路有关。