通塞脉微丸干预缺血性脑中风大鼠的脑组织代谢组学研究

目的研究缺血性中风模型大鼠脑组织代谢的变化特点和通塞脉微丸对异常代谢的调节作用,寻找通塞脉微丸治疗缺血性脑中风可能的代谢生物标志物,以探索通塞脉微丸治疗缺血性脑中风的作用机制。方法采用电凝法制造大鼠缺血性中风模型,将大鼠分为模型组、假手术组、通塞脉组和阳性药组,运用气相色谱-质谱(GC-MS)技术,对各组脑组织中内源性代谢物进行测定,采用偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)对多变量数据进行分析,t检验方法进行显著性统计分析。结果模式识别中模型组大鼠能较好地与其他3组分开。与假手术组大鼠相比,模型组大鼠脑组织中的丙氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、柠檬酸、组氨酸、花生四烯酸(AA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量升高,而核糖、6-磷酸葡萄糖和肌苷的含量下降,提示脑组织中这10种内源性物质为脑缺血的潜在生物标志物。这些内源性物质在通塞脉组大鼠体内得到了不同程度的恢复,而花生四烯酸和二十二碳六烯酸在通塞脉组与模型组大鼠体内的含量有明显差异,说明通塞脉微丸对花生四烯酸和二十二碳六烯酸这两种潜在生物标志物有明显的调节作用。结论通塞脉微丸可以使造模后大鼠的体内代谢物含量有不同程度的恢复,提示其治疗作用可能与相关代谢通路的调节有关。

基于“工艺-指纹图谱-效应”模式构建通塞脉微丸谱效相关性指纹图谱

目的基于"工艺-指纹图谱-效应"研究模式探讨构建通塞脉微丸谱效相关性指纹图谱的研究。方法以通塞脉微丸为研究对象,通过不同提取分离工艺引起该中间提取物中化学成分组成的改变,进而引起指纹图谱特征信息变化和主要药效学变化,利用UPLC/MS-Q-TOF技术对通塞脉微丸不同工艺中间提取物化学成分进行了初步解析,结合药效学实验数据,运用层次分析法探讨通塞脉微丸谱效相关性,构建谱效相关性指纹图谱。结果肉桂酸、绿原酸、LS-A2、阿魏酸等20个化合物对于通塞脉微丸药效活性的贡献值较其他化学成分高。结论基于"工艺-指纹图谱-效应"模式研究构建中药复方制剂谱效相关性指纹图谱,是表征复方整体成分-药效相关性的有效途径。

通塞脉微丸活性成分的大鼠在体肠吸收研究

目的考察通塞脉微丸中的活性成分在大鼠不同肠段的吸收动力学及微丸与标准品的吸收差异,评价该制剂用药的合理性。方法采用大鼠在体小肠吸收实验方法。结果微丸中活性成分在小肠各部位均能较好地吸收,无特异性吸收部位。不同浓度溶液对甘草苷、阿魏酸和甘草酸铵的吸收无影响;浓度对肉桂酸吸收有差异,可能借助载体转运。结论标准品中甘草苷、甘草酸铵和肉桂酸较微丸吸收快,阿魏酸无显著差异,提示微丸维持药效更持久。

通塞脉微丸化学成分的HPLC/MS研究

目的:研究通塞脉微丸中的化学成分。方法:通过高效液相色谱可将三萜、黄酮及有机酸类等10余种化学成分较好的分离。根据紫外光谱可大致判断其化合物类型,由电喷雾质谱得到各成分的分子量,进而推测出其中主要成分的可能结构。结果:发现可能有绿原酸、甘草苷、夏拂托苷、甘草素-4’-芹糖葡萄糖苷、异甘草素葡萄糖芹糖苷、木犀草苷、安格洛苷C、异甘草苷、木犀草素、异甘草素、甘草糖苷B、甘草酸单铵盐、甘草酸等13个化合物。结论:通过对通塞脉微丸化学成分的解析,为阐明通塞脉微丸的药效物质基础提供有力的证据。

通塞脉微丸活性部位群化学成分的研究

目的分离鉴定通塞脉微丸活性部位群中的化学成分。方法通塞脉微丸活性部位群经硅胶柱层析分离,IR,NMR和MS方法确定结构。结果分得9个化合物,经鉴定分别是:肉桂酸,阿魏酸,甘草素,木犀草素,异甘草素,甘草苷,咖啡酸,绿原酸,甘草次酸。结论通塞脉微丸中主要活性部位群是黄酮类、酚酸类及皂苷类等。

通塞脉微丸及中间体中总黄酮含量的紫外分光光度法测定

目的测定通塞脉微丸及中间体中总黄酮的含量。方法采用紫外分光光度法。结果选择甘草苷为标准品,标准曲线方程为：A=24.667C-0.034 46（r=0.999 9）,通塞脉微丸总黄酮的含量范围在17%～21%之间;通塞脉微丸中间体总黄酮的含量范围在27%～29%之间。平均加样回收率为99.44%（n=6）,RSD为0.97%。结论该方法操作简便,结果可靠,重复性好,可作为该制剂质量控制的方法。

通塞脉微丸和丁基苯酞对PC12细胞缺氧缺糖损伤模型的保护作用

目的探讨通塞脉微丸和丁基苯酞对PC12细胞缺氧缺糖损伤模型的保护作用。方法以肾上腺嗜铬瘤克隆化细胞株PC12细胞为材料,制备缺氧、缺糖损伤模型;MTT法测定PCl2细胞存活数及乳酸脱清酶法测定细胞损伤程度。结果形态学检查发现,通塞脉微丸和丁基苯酞对两种损伤模型中的PC12细胞具有明显保护作用,MTT染色和乳酸脱氢酶活性测定显示,通塞脉微丸和丁基苯酞可显著提高损伤模型中PC12细胞的存活数,降低细胞损伤程度,其中以对缺氧损伤保护作用尤为显著。结论通塞脉微丸和丁基苯酞对PC12细胞缺氧和缺糖损伤模型均有显著保护作用。

通塞脉微丸有效部位群在大鼠体内的吸收特征

目的考察通塞脉微丸有效部位群中的主要成分在大鼠不同肠段的吸收动力学特征及不同药物浓度的影响。方法采用在体大鼠在体小肠吸收实验方法。结果通塞脉微丸有效部位群中总黄酮在不同药物的质量浓度5、10、20g·L^(-1)于整段小肠中的4h累计吸收百分比为38.14%、42.97%、43.80%;绿原酸分别为46.87%、50.35%、48.12%;肉桂酸分别为78.33%、76.54%、54.68%;甘草酸铵分别为25.61%、28.85%、27.87%。总黄酮在十二指肠、空肠、回肠、结肠的吸收速率常数分别为0.1593、0.1054、0.1642、0.1418h^(-1);绿原酸分别为0.4404、0.296 8、0.3980、0.6025h^(-1);肉桂酸分别为0.4121、0.3537、0.2926、0.1985h^(-1);甘草酸铵分别为0.1165、0.1044、0.1025、0.0954h^(-1)。结论通塞脉微丸有效部位群中这4种成分在肠道中均吸收良好,初步确定总黄酮、绿原酸和甘草酸铵吸收机制为被动扩散,肉桂酸可能存在主动转运机制。

UV法测定通塞脉微丸及中间体中总皂苷的含量

目的测定通塞脉微丸及中间体中总皂苷的含量。方法采用紫外分光光度法。结果选择甘草酸铵为对照品,标准曲线方程为:A=2.3017C+0.06078(r=0.9995),在0.078～0.702mg范围内有良好的线性关系,通塞脉微丸总皂苷的含量范围在46%～48%之间。通塞脉微丸中间体总皂苷的含量范围在67%～70%之间。平均加样回收率为100.81%(n=6),RSD为1.7%。结论该方法操作简便,结果可靠,重现性好,可作为该制剂质量控制的方法。

通塞脉微丸干预缺血性中风模型大鼠的血浆代谢组学研究

目的:通过分析缺血性中风模型大鼠血浆内小分子的变化,研究缺血性中风导致的代谢异常变化及通塞脉微丸对异常代谢的调节作用,寻找缺血性脑中风模型可能的代谢生物标志物,探索通塞脉微丸的代谢性作用机制。方法:采用电凝法造成大鼠缺血性中风模型,将大鼠分为模型组、假手术组、通塞脉组和阳性药组,每组8只。通塞脉组按生药量13.2 g.kg-1.d-1灌胃给药,阳性药组给予尼莫地平32 mg.kg-1.d-1,模型组、假手术组灌服等体积蒸馏水,连续给药7 d。采集模型组、假手术组血浆和通塞脉组、阳性药组大鼠给药第1,3,7天的血浆,采用气相色谱-质谱(GC-MS)对血浆中内源性分子进行测定,采用偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)对多变量数据进行分析并建立模型,t检验方法进行统计分析。结果:与假手术组大鼠相比,模型组大鼠血浆中的丙酮酸、牛磺酸、羟脯氨酸的含量明显升高,而乳酸、甘油酸、氨基丙二酸、果糖、色氨酸和亮氨酸显著下降,提示血浆中这9种内源性物质为脑缺血的潜在生物标志物。通塞脉微丸给药使得上述内源性物质(除牛磺酸)得到了不同程度的恢复。结论:通塞脉微丸可以使造模后大鼠血浆中异常变化的代谢物水平有不同程度的恢复,提示其药效作用可能与其对相关代谢途径的调节有关。

不同辅料对通塞脉浸膏粉体物理性质及其微丸成型性的影响研究

目的:初步探讨通塞脉浸膏与不同辅料混合物的物理性质与其微丸成型性的相关性。方法:通过测定不同处方混合物的内聚力、塑性指数及所成微丸粉体学性质,运用主客观赋权法及多元回归分析其相关性。结果:混合物的塑性指数对微丸成型起主要影响,在所考察范围内呈正相关,内聚力与微丸成型呈负相关。结论:混合物的物理性质能显著地影响微丸成型。

UPLC-MS/MS法同时测定通塞脉微丸中10种有效成分

目的建立同时测定通塞脉微丸中10种有效成分（绿原酸、芹糖甘草苷、毛蕊异黄酮苷、木犀草苷、甘草苷、阿魏酸、异甘草苷、哈巴俄苷、甘草素和肉桂酸）的超高效液相色谱．串联质谱（UPLC-MS／MS）分析方法。方法采用BEHC18（100mmX2．1mm，1．7gm）色谱柱，流动相为乙腈．0．1％甲酸水溶液，梯度洗脱，体积流量为0_3mL／min，采用电喷雾电离源（ESI），多反应离子监测（MRM）扫描方式进行检测。结果10种成分线性关系分别为绿原酸Y=294．09肿17624；芹糖甘草苷Y=19．296x＋748．42；毛蕊异黄酮苷Y=670．8x＋11121；木犀草苷Y=490．45Ⅸ＋2938．3；甘草苷y=33．489x＋555；阿魏酸y=127．76x＋1343．5；异甘草苷y=57．87X＋804．81；哈巴俄苷y=13．125X-20．365：甘草素Y=29．057x＋367．71；肉桂酸y=72．867x＋1301．5，且各相关系数（r）均大于0．9990。精密度、重复性和稳定性良好；加样回收率在96．00％104．67％，RSD值均小于3％。结论所建立的方法准确、快捷，重复性好，可用于通塞脉微丸中绿原酸、芹糖甘草苷、毛蕊异黄酮苷、木犀草苷、甘草苷、阿魏酸、异甘草苷、哈巴俄苷、甘草素和肉桂酸10种有效成分的同时测定。

UPLC法测定通塞脉微丸中绿原酸、阿魏酸、甘草苷、肉桂酸的含量

目的:建立同时测定通塞脉微丸中绿原酸、阿魏酸、甘草苷、肉桂酸4种成分的超高效液相色谱(UPLC)分析方法。方法:采用Waters AcquityUPLC系统,AcquityUPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱,以乙腈-0.1%甲酸水为流动相,梯度洗脱,双波长检测(λ1=276 nm、λ2=327 nm),柱温35℃。结果:绿原酸、阿魏酸、甘草苷、肉桂酸在16 min内即达到基线分离,在测定的浓度范围内线性关系良好(r≥0.9997),各成分的平均回收率在95.1%～98.2%,RSD<4.0%。结论:UPLC分离效果及重复性好,且快速、简便,可作为通塞脉微丸的质量控制方法。

HPCE法测定通塞脉微丸中甘草苷、甘草素和阿魏酸的含量

目的:研究HPCE法同时测定通塞脉微丸中甘草苷、甘草素和阿魏酸的含量。方法:以葛根素为内标,40mmol·L-1四氢硼钠(pH9.18)-甲醇(90∶10)为运行缓冲液。采用未涂层弹性石英毛细管柱(75μm×50cm,有效长度42.5cm),分离电压20kV;进样压力5kPa,进样1.5s;毛细管温度:25℃;二极管阵列检测,测定波长λs=320nm,λR=380nm。结果:在上述条件下,通塞脉微丸中甘草苷、甘草素和阿魏酸在25min内得到很好的分离,加样回收率分别为99.3%,98.7%,100.2%;RSD分别为3.2%,2.6%和1.7%。结论:本方法具有良好的精密度和回收率,可作为通塞脉微丸质量控制的方法。

通塞脉微丸HPLC指纹图谱的研究

目的:通过通塞脉微丸指纹图谱的研究,建立该制剂稳定、可重复的质量控制手段。方法:以Zorbax 80A Extend-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)为色谱柱,流动相为乙腈-0.1%磷酸溶剂系统,线形梯度洗脱,检测波长为276 nm,柱温30℃;采用指纹图谱相似度软件进行数据分析。结果:建立了通塞脉微丸的HPLC对照指纹图谱,标示了21个共有色谱峰,通过与单味药及相应阴性制剂的比较确认了这21个色谱峰的归属;10批样品的色谱指纹图谱的整体相似度在0.984以上。结论:通塞脉微丸HPLC指纹图谱的建立,对有效控制通塞脉微丸成品制剂的质量具有重要意义。

通塞脉微丸高效毛细管电泳指纹图谱的研究

目的:建立通塞脉微丸高效毛细管电泳指纹图谱。方法:以pH 9.18,40 mmol·L-1硼砂-10%甲醇溶液为运行缓冲液,采用未涂层弹性石英毛细管柱(75μm×56 cm,有效长度50.0 cm),分离电压25 kV;进样压力5 kPa,进样2.0 s;毛细管温度25℃;二极管阵列检测,检测波长254 nm。结果:以10个批次的通塞脉微丸为样品建立了通塞脉微丸的毛细管电泳指纹图谱,确认共有指纹峰16个,并确定了甘草苷、甘草素、甘草酸单铵盐、肉桂酸、绿原酸、阿魏酸的峰。结论:此方法简单、快速、高效,为通塞脉微丸的全面质量控制提供了科学依据。

怀牛膝“性善下行”对通塞脉微丸中绿原酸、异甘草苷、哈巴俄苷和甘草素体内药代动力学影响研究

为了探索怀牛膝对通塞脉微丸中主要活性成分绿原酸、异甘草苷、哈巴俄苷和甘草素在大鼠体内的药动学参数的影响,该研究建立了UPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中绿原酸、异甘草苷、哈巴俄苷和甘草素4种成分的分析方法,色谱柱为BEHC18(2.1 mm×100 mm,1.7μm);流动相为乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱,流速为0.3 mL·min-1,采用电喷雾电离源(ESI),多反应离子监测(MRM)扫描方式。结果显示,通塞脉微丸组4种成分的Cmax和AUC0-∞均比通塞脉微丸加牛膝组高,其中绿原酸的Cmax差异显著(P<0.05),绿原酸和甘草素的AUC0-∞差异显著(P<0.05);2组间Tmax和CL均无显著性差异。该研究建立的UPLC-MS/MS方法特异、快速、准确和灵敏,可用于通塞脉微丸中4种主要活性成分在大鼠体内的药代动力学研究;同时表明怀牛膝对通塞脉微丸中4种主要活性成分在大鼠体内药代动力学行为有不同程度的影响。