蓝猪耳组织培养和植株再生条件研究

以蓝猪耳(Toreniafournieri)叶片为外植体,研究了离体培养条件过程中多种物理化学因素对蓝猪耳愈伤组织的形成和植株再生的影响,进而筛选出了离体培养的最优条件.

蓝猪耳精细胞的分离及两个精细胞群体的收集

蓝猪耳是二细胞型花粉,生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精细胞。用体内-体外技术培养出花粉管后,将其置于爆破液中即可释放出花粉管内含物,其中包括两个精细胞和营养细胞。在显微镜下两个精细胞具二型性:体积较大的精细胞与花粉管的营养核相连,体积较小的精细胞只与大精细胞连接。两个精细胞之间的连接比较结实,需用微量酶液将两个精细胞分开。用显微操作仪就可分别挑选出两个精细胞群体,分别有上百个细胞。蓝猪耳精细胞的成功分离为利用蓝猪耳开展离体受精研究打下了良好的基础。这种单一纯化的精细胞群体的获得为用分子生物学方法区分两个精细胞的特异基因和蛋白质创造了条件。

夏堇花成色色素分析

从夏堇2个栽培品种‘粉月’和‘蓝月’的花中提取色素,用紫外分光光度计法、薄层层析色谱法和高效液相色谱法对其成色色素进行了检测。结果表明:夏堇花的主要成色色素为黄酮类化合物,其中‘粉月’中主要成色色素为矢车菊素、芍药素、芹菜素和木犀草素,‘蓝月’中主要成色色素为飞燕草素、锦葵素、矮牵牛素、芹菜素和木犀草素。

蓝猪耳再生系统的建立

采用4因子3水平的正交设计,研究外植体种类、NAA、6-BA和光照处理对蓝猪耳愈伤组织诱导的影响,结果表明,光照下带有根的完整植株生长在MS+NAA0.5mg/L+6-BA2mg/L的培养基上能够诱导出大量的愈伤组织。比较了不同外植体在诱导愈伤组织出现的时间、形态、质地和颜色等方面的差别。无菌苗的幼叶在培养基MS+NAA0.1mg/L+6-BA2mg/L中不定芽诱导率最高,达到81.3%,在MS+NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上有效不定芽数最多,在MS+NAA0.1～0.5mg/L培养基中无根的植株能够诱导出大量的不定根。

蓝猪耳胚囊结构观察方法的比较

采用不同显微镜和染料对蓝猪耳(Torenia fournieri Lind.)胚囊结构进行了比较观察。结果表明,Leica DM5000B显微镜和Leica DMI4000B荧光显微镜不适合观察、拍摄胚囊超微结构,Leica DMRXA显微镜基本符合要求,激光共聚焦显微镜效果最好。普通显微镜下即可观察到未染色材料的胚囊,染色后效果更佳。爱氏苏木精染色,胚囊着色浅且不均匀;曙红Y染色,需在荧光显微镜下观察、拍照。荧光染料(DAPI、鬼笔环肽、碘化丙啶和罗丹明)染色后,采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察胚囊结构特征,效果良好。

钙和硼对蓝猪耳花粉萌发及花粉管生长的影响

研究了钙(Ca2+)和硼(H3BO3)对蓝猪耳花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明:(1)在一定范围内Ca2+几乎不影响花粉萌发频率,而主要影响花粉萌发速度和花粉管生长速度;低Ca2+不利于花粉管生长,而高Ca2+抑制花粉萌发速度和花粉管生长;在稍高于最适Ca2+浓度的条件下,花粉管生长早期呈现波浪形。(2)硼明显影响花粉萌发频率及花粉管形态;花粉管生长必需硼,但不同浓度的硼对花粉管生长速度影响不明显;在高浓度硼条件下,较长时间内花粉管均呈现出波浪形。(3)Cooled-CCD动态跟踪观察进一步证实Ca2+影响花粉管生长速度,而硼则不明显。

烟草与蓝猪耳胚胎发生中细胞表面三种凝集素受体的动态分布

以异硫氰酸甲酯 (FITC)标记的三种凝集素 (伴刀豆凝集素 ,麦芽凝集素和大豆凝集素 )为荧光探针 ,对烟草及蓝猪耳各发育时期胚细胞表面的凝集素受体进行了定位。结果显示胚柄基部荧光信号最强 ,沿胚柄单列细胞向胚体方向渐次减弱。以后随着胚柄功能的逐渐丧失而改变。同时 ,三种凝集素受体集中分布于胚柄细胞间的分裂面 ;凝集素受体在原胚中分布的另一个特点是聚集于新形成的细胞壁上。随着胚胎发育至分化阶段 ,凝集素受体则主要分布在胚体细胞的外切向壁上 ;

蓝猪耳叶片高频率再生体系的建立

以蓝猪耳(Torenia fournieri Linden)叶片为外植体,研究多种因素对蓝猪耳不定芽诱导及不定根形成的影响,并进行了条件优化,建立了蓝猪耳叶片高频率离体再生体系.结果表明:芽诱导与基本培养基成分关系不大,而与植物生长物质的浓度和种类有关,其中以MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L状态最佳;不定根形成受到植物生长物质和培养基中离子浓度的共同影响,最佳生根条件为1/2 MS+IBA 0.2 mg/L.

蓝猪耳启动子捕获系统的建立

为了分离基因启动子,构建了陷阱植物表达载体pHAHCA,用农杆菌介导的无启动子GUS方法转化蓝猪耳,经抗性筛选和PCR检测,获得82株转基因植株,转化率达12.5%。12株GUS染色呈阳性,其中10株GUS在叶脉表达,2株在茎和叶脉表达。对转基因植株进行盐胁迫处理,有1株根部出现GUS染色蓝色斑点。通过TAIL-PCR扩增和测序,获得5个T-DNA侧翼序列。

蓝猪耳的繁殖及其在荆州园林应用的调查分析

以蓝猪耳(Torenia fournieri)为试验材料,研究了近年来其在华中地区(以荆州市为代表)的繁育及园林应用可行性状况。结果表明,蓝猪耳在荆州的生长状态良好,单株花朵数可达147朵左右,花期长达133 d,结实率达到41.89%。通过对荆州市典型小区(油院小区,城南春天,悉尼印象,荆州花园)、重点街道(江津路,北京路)和典型性公共园林绿地(沙隆达广场)的园林植物进行应用性评估,发现当地的园林植物应用存在系列问题,如植物造景材料老化、园林绿化所选用的植物与建筑风格不符以及绿化未能与时俱进等缺陷。采用典型绿地实地考察与模拟应用相结合的形式,对蓝猪耳在荆州园林绿地的应用效果及前景进行了可行性分析。总体而言,蓝猪耳在荆州的园林绿化中可以大规模引进和采用。

蓝猪耳花粉管细胞壁超微结构的FESEM和AFM比较研究

[目的]比较场发射扫描电镜(FESEM)和原子力显微镜(AFM)观察蓝猪耳花粉管表面形貌和细胞壁中纤维素微纤丝排列的效果。[方法]蓝猪耳花粉离体培养2 h后,利用FESEM和AFM原位观察无损的花粉管表面形貌和细胞壁的精细结构。[结果]FESEM可见花粉管表面粗糙的网状结构;AFM可获得花粉管的三维立体图像,并可见花粉管细胞壁物质的精细结构和纤维素微纤丝的排列情况。[结论]AFM是一种观察花粉管表面结构和细胞壁中纤维素微纤丝排向的有效手段。

蓝猪耳花粉萌发和花粉管生长的影响因素

[目的]探讨蓝猪耳花粉管的最佳培养条件,为建立植物离体受精体系奠定基础。[方法]采用离体培养技术,研究了蓝猪耳花粉离体萌发和花粉管体外生长的主要影响因素。[结果]蓝猪耳花粉萌发及花粉管生长的最佳培养基为:5.00%(V/V)蔗糖、0.01%(V/V)氯化钙、0.01%(V/V)硼酸和0.01%(V/V)磷酸二氢钾,其培养基的渗透压主要靠蔗糖调节。[结论]硼是蓝猪耳花粉萌发中必不可少的微量元素;钙对花粉管生长起着非常重要的调节作用,并推测钙离子主要是通过电压依赖型钙通道进入花粉管内部。

三种提取蓝猪耳总DNA方法的比较

针对蓝猪耳(Torenia fournieri L.)叶片中多糖、色素等物质严重干扰总DNA提取质量的问题,以蓝猪耳叶片为试验材料,分别采用高盐低pH值法、SDS法、CTAB法提取总DNA,并从样品电泳图谱、纯度、得率等方面对三种方法进行评价。结果表明,CTAB法提取总DNA的产率较高、纯度最好,是蓝猪耳总DNA提取的最佳方法。

夏堇悬浮细胞培养与植株再生研究

以夏堇品种"小丑"的组培苗幼嫩叶片为试材,进行愈伤组织诱导、细胞悬浮培养及植株再生诱导的研究。结果表明:MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D的培养基能够使叶片诱导为生长迅速、质地疏松的愈伤组织。愈伤组织最适宜的悬浮培养条件为:MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L 2,4-D液体培养基,20g/L的起始接种量以及100r/min的震荡培养。将继代3～4次的细胞悬浮颗粒转到1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA的固体再生培养基上培养,3周后可以诱导分化出芽,进而获得完整植株。悬浮培养有利于夏堇愈伤组织的再生,悬浮培养对提高以夏堇作为模式植物进行的相关研究具有重要的应用价值。

转化pCAMBIA1301载体蓝猪耳F_1代植株的花粉育性研究

通过自花和异花授粉、电镜扫描、花粉活力测定等方法,对转pCAMBIA1301基因蓝猪耳的9个转基因株系的F1代植株的育性进行了研究.结果表明：蓝猪耳不存在自交不亲和现象但其转基因植株出现花粉败育;对9个转基因株系进行测定,发现其花粉活力与对照（77.3%）差异显著,仅为9.8%- 30.6%,表明转基因蓝猪耳花粉败育不是由于基因的插入引起的,普通培养基组培瓶蓝猪耳花药活力与在土壤中萌发的蓝猪耳花粉活力均为75%左右,表明组培环境也不是引起花粉败育的原因,因此继代培养基是引起花粉不育的唯一原因.

蓝猪耳花粉管在雌蕊生长途径中钙的分布特征

采用焦锑酸钾沉淀法研究蓝猪耳(Torenia fournieri)花粉管在雌蕊生长途径中钙的分布特征。蓝猪耳花粉从萌发至花粉管生长进入子房过程中,花粉管壁上的钙沉淀颗粒保持较多;管内的钙沉淀颗粒先增多后减少,花粉管进入子房时管内几乎没有钙沉淀颗粒;管外相邻花柱组织的钙沉淀颗粒先增多再减少又增多,直至花粉管进入子房时子房室内有大量的钙沉淀颗粒。蓝猪耳体内生长的花粉管钙也呈梯度分布,且随花粉管不断生长钙梯度分布更加明显。蓝猪耳的花柱未授粉时已出现明显的钙梯度分布特征,并且授粉后花粉管生长到达的部位均有较为丰富的钙。以上结果显示:花粉萌发时,花粉中有足够的钙满足花粉萌发;花粉管生长过程中,钙不断从花柱组织细胞中内流进入花粉管,满足花粉管的生长;花粉管进入子房室,管内无需太多的钙,而管外高钙环境有助于花粉管进入珠孔;蓝猪耳花柱的钙梯度分布对其中生长的花粉管具有引导作用。

蓝猪耳合子和二胞原胚细胞的分离(简报)

合子是被子植物个体发育的第一个细胞。合子分裂的规律性是植物早期胚胎发生的种属甚至是科的特征，也是控制早期个体发育的关键阶段。许多被子植物的合子分裂形成二胞原胚时就呈现出调控个体发育的迹象：顶细胞继续分裂形成胚体，以后发育为胚，而基细胞则分裂数次或不分裂形成胚柄结构。卵细胞和合子发育过程中的特异基因表达是配子体发育转向孢子体发育的一个关键事件之一。受精和早期胚胎发生的分子机制在动物中一直被广泛研究，而对高等植物受精后合子基因组的激活所知甚少。

蓝猪耳大孢子发生和雌配子体发育

[目的]研究蓝猪耳大孢子发生和雌配子体发育。[方法]采用常规石蜡切片和超薄切片技术研究蓝猪耳大孢子发生和雌配子体发育过程。[结果]蓝猪耳为中轴胎座,倒生胚珠,单珠被,薄珠心。大孢子母细胞减数分裂形成T-形和直线形四分体。T-形四分体合点端大孢子具功能,胚囊为蓼型发育形式;直线形四分体中珠孔端大孢子具功能,最终形成八核七细胞的成熟胚囊。胚囊发育异常偶有发生,但大部分胚囊都能发育成正常的7-细胞胚囊。[结论]蓝猪耳雌性生殖细胞发育异常并不是其结实率低的主要原因。

蓝猪儿组织培养和再生

光照有利于蓝猪儿(Torenia fournieri)种子的萌发。上胚轴转接在生芽培养基(MS + 0.1 mg/L 4PU + 2 mg/L NAA) 上,25℃,光暗16/8h培养18d,芽发生,25d不定芽数目达7～8个。叶或茎形成愈伤组织的适宜培养基为MS + 0.05 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L NAA,愈伤组织再分化形成芽的能力较弱。1/2 MS培养基无论是否添加萘乙酸,蓝猪儿试管苗都能发生不定根,萘乙酸使不定根的数目增多,分布密集。

蓝猪耳花药发育中多糖和脂滴的组织化学研究

对蓝猪耳花药发育中营养物质的分布和转化过程进行组织化学研究,结果表明:在造孢细胞时期,药壁细胞没有营养物质的积累,但在造孢细胞中有少量的脂滴;在小孢子母细胞时期,表皮细胞中出现淀粉粒,而在绒毡层细胞中出现脂滴,小孢子母细胞中也有脂滴的分布;在四分体时期,四分体小孢子中出现淀粉粒,绒毡层细胞脂滴增加;在小孢子早期,药室内壁细胞中出现淀粉粒,绒毡层继续积累脂滴,而小孢子中开始出现脂滴;到小孢子晚期,绒毡层细胞降解,细胞残留物中出现较多脂滴;在二胞花粉早期,花粉中的大液泡消失,花粉开始积累淀粉粒;在即将开花的成熟花粉中则积累了大量的脂滴和少量的淀粉粒。蓝猪耳花药发育中多糖和脂滴两种营养物质的积累和分布具有一定的时、空特点,反映出花药发育中营养物质积累的规律。