刚地弓形虫P30基因的克隆及编码蛋白结构与抗原表位的生物信息学分析

目的克隆刚地弓形虫P30基因,从生物信息学角度分析P30基因编码蛋白的结构与抗原表位,预测该蛋白的免疫原性。方法提取刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子总RNA,进行RT-PCR扩增,扩增产物经NheI和AflⅡ双酶切后与真核表达载体PVAXI连接,转化后通过菌落PCR、双酶切和测序鉴定。使用Protparam、Protscal、SOSU、SWISS-MODEL、SOPMA、Bcepred和TMHMM等在线分析工具,分析P30蛋白的物理和化学性质、亲水性、疏水性、二级结构、表面可及性、柔韧性、细胞定位、跨膜结构域、信号肽、翻译后修饰位点、结构域、功能域、抗原表位和三级结构。结果RT-PCR扩增大小为789 bp,菌落PCR显示,在约789 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符,阳性PVAXI-P30重组质粒经Nhel和AflⅡ双酶切获得大小为789 bp和3000 bp的两条条带,大小与目的基因和载体片段相等,测序结果显示,P30基因大小为789 bp,与GenBank的P30基因(登录号为X14080.1)核苷酸序列一致性为100%。P30蛋白含有336个氨基酸,分子式为C_(1525)H_(2459)N_(409)O_(477)S_(21),相对分子质量为34.83×10^(3),理论等电点(8.34),不稳定指数(36.70),脂溶性指数(80.15),消光系数(20970),A_(280)(0.602),P30亲水性氨基酸分布在整条链上,具有两亲性,在P30蛋白的336个氨基酸中,α-螺旋(Hh)占22.32%,β-折叠(Ee)占26.49%,β-转角(Tt)占8.04%,无规则卷曲(Cc)占43.15%,表面可及性参数得分≥1.9的区域是11个,柔韧性参数得分≥2.0的区域和亲水性参数得分≥1.9的区域均有6个,翻译后修饰位点有6个,保守结构域有5类,潜在B细胞抗原表位共13个,8个潜在限制性CTL细胞抗原表位,13个潜在辅助T细胞抗原表位,P30蛋白最有可能是定位于真核细胞线粒体内的可溶性表达蛋白。结论刚地弓形虫P30基因编码的蛋白为可溶性表达蛋白,具有免疫原性,可为弓形虫病疫苗的研制提供理论基础。

弓形虫缓殖子期抗原1的原核表达及其多克隆抗体制备与初步应用

目的对弓形虫缓殖子期抗原1(BAG1)基因进行优化、克隆、原核表达,表达产物纯化后免疫小鼠,制备BAG1多克隆抗体,评价重组蛋白的免疫原性,并观察BAG1在虫体内的定位。方法对bag1基因序列进行筛选和优化,利用生物信息学方法分析其编码蛋白的氨基酸序列结构和功能,预测其免疫原性。将合成的pET28a(+)-bag1质粒转化至BL21感受态细胞中,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度l mmol/L,37℃诱导4 h,用HIS标签蛋白纯化试剂盒纯化表达蛋白。取纯化蛋白做SDS-PAGE凝胶电泳分析,用BCA法测定蛋白浓度。取7只BALB/c小鼠,取纯化的BAG1蛋白与等体积的弗氏佐剂按双推法混匀,皮下多点注射免疫小鼠,每鼠每次注射蛋白25μg(第一次使用弗氏完全佐剂,后两次均使用弗氏不完全佐剂,每隔两周免疫一次),末次免疫4 d后摘眼球取血,分离血清,以此为一抗,采用Western blot检测碱性条件下我国流行优势基因型Chinese 1虫株(TgCtwh6)速殖子向缓殖子转化及含有TgCtwh6包囊小鼠脑组织中的BAG1蛋白,间接免疫荧光(IFA)试验检测TgCtwh6虫株碱性诱导成为缓殖子情况。结果预测BAG1含有7个潜在抗原表位,具有良好的免疫原性。Western blot显示,BAG1多克隆抗体能识别在体外碱性培养基诱导的TgCtwh6和小鼠脑组织内形成的TgCtwh6虫株缓殖子;IFA结果显示,BAG1多克隆抗体能识别体外诱导的TgCtwh6缓殖子,且BAG1蛋白主要定位在弓形虫的胞质中。结论成功制备弓形虫BAG1多克隆抗体,该抗体能识别我国优势流行虫株的BAG1蛋白及缓殖子,为我国流行虫株的监测和鉴定提供了良好的手段。