Ion Torrent半导体测序联合MLPA技术检测神经纤维瘤患者的致病突变

目的建立临床适用的神经纤维瘤病(NF)的分子遗传分析方法,对NF进行分子遗传诊断和遗传咨询,并对NF家庭进行产前诊断。方法以南京医科大学附属妇产医院遗传咨询门诊收治的18例NF患者为研究对象,收集患者及其家属的外周血标本并提取基因组DNA,应用Ion Torrent半导体测序技术进行NF1/NF2基因测序并结合多重连接探针扩增反应(MLPA)检测,筛选致病突变并用Sanger测序验证,结合亲子二代的分子遗传检测结果,制定适当的临床干预和随访计划。在NF家系母亲再次妊娠时,对胎儿进行产前诊断。结果应用Ion Torrent半导体测序技术检测出9例致病突变和1例可疑致病突变,其中包括3个未报道过的新突变;应用MLPA技术检测出1例拷贝数大片段缺失。对其中5个家系的孕妇行羊膜腔穿刺术抽取羊水进行产前诊断,其胎儿均不携带家系的致病突变。结论基于Ion Torrent半导体测序及MLPA技术建立的基因诊断方法可为NF临床诊断及遗传咨询提供分子遗传学依据,具有较高的临床应用价值。

Ion Torrent PGM测序在87例无精子症Y染色体微缺失分析中的应用

目的:探究Ion Torrent PGM测序技术在Y染色体微缺失检测中的可行性。方法:收集非梗阻性无精子症患者87例作为实验对象,全部完成精液常规、生殖激素和染色体核型分析。以多重PCR法作为对照,用Ion Torrent PGM测序技术检测Y染色体微缺失,比较两种方法的检出率。结果:PGM测序法检出率为49.4%,多重PCR法检出率为12.6%,Ion Torrent PGM的检出率明显高于多重PCR,Ion Torrent PGM检出的AZF缺失患者包含全部多重PCR检出患者,且缺失位点完全一致。同时,在87例男性不育患者中,Ion Torrent PGM检出24例,共14种男性不育相关基因突变,总阳性率为27.59%。结论:对无精子症患者,采用Ion Torrent PGM测序检测AZF缺失,可明显提高检出率;同时PGM测序法可以检出更多的男性不育相关基因突变位点,为无精子症的诊断提供帮助。

Ion Torrent PGM测序技术在MPN患者临床诊断中的方法学建立

目的:探讨通过自主设计定制的MPN致病相关基因的多重PCR引物试剂盒,使用Ion Torrent PGM第二代测序平台快速和准确地获取MPN患者基因突变信息的可行性和可靠性。方法:收集2015年1月至2015年10月就诊于南方医院血液科,经Sanger测序法检测JAK2V617F+和(或)CALR+、Ph-的10例MPN患者骨髓标本,然后使用Ion Torrent PGM第二代测序复核检测骨髓并对比两种方法结果的一致性。结果:Ion Torrent PGM第二代测序检测JAK2V617F、CALR和MPL就这3个基因而言,所有样本CALR基因52 bp缺失均未被检测出,其余测序结果与Sanger测序结果完全一致。结论:Lon Torrent PGM测序平台检测MPN患者多个基因突变,方法上具有可行性,能满足临床检测需求。本研究方法在1-2 d内可完成23个基因突变检测,具有灵敏、特异、快速、高通量及低成本的优势。

Ion Torrent PGM^(TM)平台在儿童遗传性疾病诊断中应用初探

目的在PCR产物定量混合构建文库方法的基础上,探讨IonTorrentPGMTM平台二代测序应用于儿科常见遗传性疾病诊断的价值。方法采集临床诊断的2例肌营养不良、1例胆汁酸合成障碍和1例甲基丙二酸血症患儿的外周血,提取基因组DNA,分别针对DMD基因、HSD3B7基因、AMACR基因及MUT基因采用PCR反应进行编码区扩增,扩增产物定量混合制备成文库,在PGM上完成测序。使用NextGENe软件进行数据分析。同时采用Sanger测序方法,对上述基因进行全基因测序;肌营养不良病例采用多重连接探针扩增(MLPA)进行基因外显子拷贝数变异的检测。结果例1肌营养不良患儿DMD基因检测到6个变异,其中c.998C>A,p.333S>X为已知致病突变位点,4个为SNP(rs228406、rs1801187、rs1801188、rs1800280)。PGM检测到1个假阳性,为6个连续的T后面插入了1个T。例2肌营养不良患儿检测到DMD基因g.2788933943-2790543577共5个外显子的缺失,MLPA检测结果与二代测序结果相符合。例3胆汁酸合成障碍患儿HSD3B7基因和AMACR基因共检测到7个变异,其中HSD3B7基因复合杂合突变c.45-46delAG,FS;c.262G>G/C,p.88G>RG,5个为SNP(rs9938550、rs3195676、rs10941112、rs2278008、rs2287939)。例4甲基丙二酸血症患儿MUT基因检测到3个变异,1个为已知致病突变位点杂合突变c.728-729het-insTT,FS;2个为SNP(rs2229384、rs8589)。PGM检测到2个假阳性。结论基于PGMTM平台、采用PCR产物定量混合构建文库测序的方法,具有低成本、高通量、高灵敏度以及可灵活设计的特点,适合用于儿科临床常见遗传性疾病的检测。但由于二代测序技术可能带来的假阳性,对于检测到的变异需要Sanger直接测序法进一步验证。

土壤微生物16S rDNA的Ion Torrent PGM高通量检测方法构建与应用

采用Ion Torrent Personal Genome Machine(PGM)测序平台,以16S rRNA基因V4-V5区为标靶,沼泽土壤和草坪土壤为材料,建立土壤微生物16S rDNA检测方法。结果表明,当测序序列数达到15 000条左右,两种土壤样品的Shannon曲线趋于平稳,而且沼泽土壤的多样性指数明显高于草坪土壤。在沼泽土壤和草坪土壤中分别检测到7 615和8 072个OTUs,分属于30门、53纲、93目、130科、182属和29门、52纲、88目、125科、183属。方差分析表明两类土壤存在着丰度差异显著的微生物类群和OTUs。根据样品间相似度分析,所有测试样本可明显分成两组,而且3个重复各自归为一组。可见,该试验所建立的Ion Torrent PGM土壤微生物16S rDNA检测法具有高通量、高灵敏度等优点,能够较为全面和准确的反映土壤微生物群落结构,从而可为土壤微生物群落结构研究提供强有力的检测工具。

TORRENT法测试混凝土空气渗透性能研究

TORRENT法是一种测试混凝土空气渗透性能的新方法。通过试验对TORRENT测试方法的校正进行了研究,并分析了混凝土密封状态、湿度、孔隙连通程度对TORRENT空气渗透性能测试结果的影响。结果表明,内腔残余气压的扣除是TORRENT测试方法校正的关键,相比于试件密封状态,湿度与孔隙连通程度对TORRENT法空气渗透性能的测试结果影响更为显著,TORRENT法在中低密实程度混凝土空气渗透性能测试过程中误差较小。

应用Ion Torrent半导体测序检测马凡综合征患者FBN1基因致病突变

目的:对3个马凡综合征(MFS)家系及1例MFS患者的原纤维蛋白1基因(FBN1)进行基因检测,以明确致病突变,为患者提供遗传咨询及产前诊断。方法:应用高通量Ion Torrent半导体测序技术对3个MFS家系的先证者及1例MFS患者的FBN1基因进行检测,筛选致病突变位点,并用Sanger测序法验证。对1例胎儿FBN1基因相应的位点进行检测,以明确其受累情况。结果:患者P1 FBN1基因检测到c.7125_7126 del TG杂合性缺失突变,为可疑致病位点;家系1患者FBN1基因检测到IVS 27-1G>C(c.3464-1G>C)杂合性突变,为致病突变;家系2患者FBN1基因检测到c.4981G>C(p.Gly1661Arg)杂合性错义突变,为致病突变,胎儿携带同样突变;家系3患者FBN1基因检测到c.1546C>T(p.Arg516Term)杂合性无义突变,为致病突变。结论:应用高通量Ion Torrent半导体测序技术检测到3个MFS家系及1个MFS患者的致病基因突变,为临床诊断及遗传咨询提供分子遗传学依据,并对1例胎儿进行了产前诊断。

Ion Torrent PGM^(TM)测序在急性髓系白血病检测中的应用

目的探讨Ion Torrent PGMTM测序平台用于急性髓系白血病(AML)患者基因突变检测的可行性。方法提取27例AML患者初次治疗前的骨髓DNA,用Ion Torrent PGMTM测序仪对50个常见的肿瘤基因热点突变区进行检测,同时用Sanger测序法检测FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)和核仁磷蛋白1(NPM1)基因的突变情况以进行验证。结果 50个目标基因中检出17个基因共29个突变位点,单个基因有多种突变方式,以单碱基替换为主。突变频率最高的是NPM1(22.2%)和FLT3(18.5%)。用Sanger测序法验证,NPM1两种方法检测的吻合度为100%,在FLT3验证中,其中有1例Sanger测序为阳性,而Ion Torrent PGMTM检测为阴性。结论 Ion Torrent PGMTM能够在短时间内得到AML患者的基因突变谱,但其在检测长片段插入/缺失中的缺陷仍需改进。

Ion Torrent测序技术检测Ⅰ型神经纤维瘤病患者NF1基因突变

目的评价Ion Torrent测序技术检测Ⅰ型神经纤维瘤(NF1)基因及其突变类型的可行性。方法提取12例NF1患者的外周血DNA,用Ion Torrent个体化基因测序仪(PGM)对患者NF1基因进行测序,用Sanger测序法验证NF1基因相应的突变位点,Ion Torrent PGM检测后覆盖缺失的外显子样本用Sanger测序法重新检测。结果检测到10例患者存在NF1基因致病突变,其中2种无义突变,5种小缺失或插入突变,1种错义突变,2种剪接突变。2例患者未检测到致病突变。结论 Ion Torrent测序技术检测含有大量外显子的NF1基因快速、准确;NF1基因突变可导致氨基酸密码子提前终止。

通往个性化医疗的新一代测序技术:Ion Torrent

自1977年第一代Sanger测序法诞生以来,测序技术经历了突飞猛进的发展,第二代和第三代测序技术相继出现。随着测序仪代次的更迭,实现测序目的的技术权重已逐渐由偏重生化反应转向偏重物理学、材料学等非生物学科。Life Technologies公司推出的Ion Torrent Personal Genomic Machine(PGM)就是这类技术转型的代表。我们对测序技术的发展和Ion Torrent PGM的特点及应用做简要综述。

Ion Torrent测序检测非小细胞肺癌外周血DNA的临床价值

目的:探讨Ion Torrent测序检测非小细胞肺癌外周血DNA的临床价值。方法:选择患者80例,分为两组,各40例,观察组利用三代测序技术Ion Torrent检测,对照组使用第1代测序技术Sanger末端终止法进行测序,比较手术前后通过Ion Torrent测序所得EGFR和K-ras结果,并统计两组测序EGFR阳性1年生存情况。结果:未手术者观察组EGFR阳性和K-ras突变阳性检出率均显著高于对照组(P<0.05),术后复发患者观察组EGFR阳性和K-ras突变阳性检出率均显著高于对照组(P<0.05),观察组1年生存率显著高于对照组(P<0.05)。结论:对非小细胞肺癌患者使用Ion Torrent测序技术测定外周血DNA,能更准确的确定患者基因类型,从而为分子靶向治疗提供依据。

Ion Torrent PGM^(TM)系统检测孕妇血浆中胎儿游离DNA

目的探讨Ion Torrent PGMTM系统用于孕妇外周血血浆中胎儿游离DNA的Y-STR检测的可行性。方法采集8例孕晚期(38周)和8例孕中期(12周)的无关孕妇外周血血浆,提取胎儿游离DNA,对DYS390、DYS391、DYS393、DYS438、DYS437、DYS456、DYS635共7个基因座进行复合扩增,在Ion Torrent PGM^(TM)系统进行Y-STR测序分析和毛细管电泳分析,并将两者结果进行比较。结果在分娩男性胎儿的孕晚期及中期孕妇血浆中均检测到Y-STR片段,测序检测得出的基因座比毛细管电泳检测得出的多,且与分娩胎儿的Y-STR基因型相一致。结论 Ion Torrent PGMTM系统用于孕妇外周血血浆胎儿游离DNA的Y-STR检测,具有高灵敏度、高通量的特点,且有较好的法医学应用价值。

基于Ion Torrent PGM^(TM)测序系统的人mtDNA全测序分析

目的应用Ion Torrent PGM^(TM)测序系统对人线粒体DNA(mitochondria DNA,mtDNA)全序列进行分析检测,研究不同组织间mt DNA序列差异情况。方法通过法医尸体检验采集6名无关个体的组织样本,包括胸腔血液、头发、肋软骨、指甲、骨骼肌和口腔上皮。使用4对引物对线粒体全序列进行扩增,应用Ion Shear^(TM)Plus Reagents试剂盒和Ion Plus Fragment Library试剂盒等构建文库,并在Ion Torrent PGM^(TM)测序系统上进行线粒体基因组全序列测序,并针对异质性位点和在HVⅠ区域突变位点,进行Sanger测序验证。结果所有样本的全基因组mtDNA都扩增成功,6名无关个体分属于6种不同的单倍型,同一个体不同组织之间mtDNA存在异质性差异。异质性位点和HVⅠ区域突变位点采用Sanger测序结果均得到验证。通过Kappa统计方法进行一致性检验后发现,相同个体不同组织的mtDNA序列检验结果仍具有较好的一致性。结论本研究所采用的人线粒体基因组全序列的测序检验方法,可以检测出同一个体不同组织间mtDNA的异质性差异,该差异具有较高的一致性,该结果对mtDNA在法庭科学中的应用具有指导作用。

基于Ion Torrent半导体测序技术的遗传代谢病基因诊断Panel临床应用

目的探讨基于Ion Torrent半导体测序的遗传代谢病基因诊断Panel的临床应用价值。方法收集109例串联质谱筛查可疑代谢病患儿及其父母的外周血标本,用基因Panel进行检测,可疑突变经Sanger测序验证。结果 109例患儿中有97例(88.99%)基因诊断明确,其中96例检测到存在与临床症状相符的2个等位基因致病突变,1例鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症为男性半合子; 11例(10.09%)仅检测到1个等位基因致病突变; 1例(0.92%)未检测到致病性突变。结论基因Panel在临床疑似遗传代谢病的检测中有较高的阳性诊断率,可为串联质谱筛查后续临床治疗和遗传咨询提供依据。

基于BitTorrent的P2P VOD系统研究

在基于C/S结构的集中服务式的传统视频点播系统中,服务器和网络带宽都会成为瓶颈,不能满足用户的需求。文中以消除传统视频点播系统中的瓶颈为目标,在视频点播系统中引入P2P技术,基于开源的高效文件共享和下载软件BitTorrent,通过改进,设计了一种P2P视频点播系统。该系统采用了集中目录式P2P结构和基于分片机制的边下载边播放模式,引入并改进了多重滑动窗口模型,具有良好的响应特性。设计了一种先下载后观看的模式,该模式可在现有的网络条件下,提供非实时的高清影片点播业务。仿真实验结果表明文中的设计有效地解决了传统VOD系统的瓶颈问题。

Ion torrent半导体测序技术在胎儿非整倍体疾病筛查中的应用

选择行无创产前检测的孕妇共6 064例,利用Ion torrent半导体测序技术进行孕妇外周血胎儿游离DNA检测,并对阳性病例进行羊水染色体核型分析,对所有研究病例随访新生儿结局。检测结果异常者共49例,其中21-三体综合征27例、18-三体综合征18例、13-三体综合征4例。其灵敏度和特异度分别为:21-三体综合征96. 3%、95%,18-三体综合征100%、93. 3%,13-三体综合征100%、100%。具有较高的灵敏度及特异度,有较高的推广价值。同时,该技术仍存在一定的假阳性及假阴性,应进一步结合其他产前诊断方法做出更准确判断。

多Torrent下基于拍卖的种子节点激励算法

针对多Torrent文件系统种子节点缺乏有效激励的问题进行了研究，指出现实中多Torrent文件系统大量存在，这为种子节点激励提供了环境；争锋相对（TFT）机制其目的是用来最大化下载带宽，但没有考虑种子节点的重要作用，因此不能用于种子节点激励。进而提出了基于拍卖的种子节点激励算法（ABSI）：种子节点对带宽进行拍卖，leecher节点进行出价，种子节点根据leecher节点的出价进行带宽分配。同时分析了该算法对种子节点的激励效果以及在此情况下节点下载时间的变化。实验表明该算法可以很好地用于种子节点激励。

基于QT的BitTorrent客户端下载工具设计与实现

BT协议基于先进的协议和方法,可极大地提高下载速度。而BT同QT的结合可以极大地发挥BT的优势和作用。文章首先分析了QT的信号和槽机制,以及BT协议的关键学法和策略,最后就其系统的设计进行了阐述。

基于Merkle树的BT系统torrent文件优化策略

BitTorrent(BT)是中心索引式的P2P系统。节点要进行下载必须从中心索引服务器获取一个扩展名为torrent的索引文件,中心索引服务器成为系统的瓶颈。文章提出一种基于Merkle树的torrent文件优化策略,使torrent文件大幅减小,减轻中心索引服务器的负担,改善BT的可扩展性。

基于Ion Torrent测序平台技术的肿瘤基因检测及临床应用

目的探讨Ion Torrent基因测序技术对肿瘤基因突变检测的准确性和临床适用性。方法提取110例癌症患者的石蜡包埋组织DNA,采用Ion Torrent基因测序技术检测患者的22个肿瘤基因,即EGFR、ERBB2、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、MET、ALK、KRAS、NRAS、BRAF、MAP2K1、STK11、PTEN、PIK3CA、AKT1、DDR2、NOTCH1、TP53、FBXW7、SMAD4、CTNNB1,用Sanger测序法对部分基因突变位点进行验证。结果 110例患者中,肺癌40例,结直肠癌40例,恶性黑色素瘤30例,基因突变检出率为100%,且所有病例均至少发生3个基因突变。EGFR、FGFR3突变率均为100%,FGFR2、MAP2K1、NOTCH1突变率均为0;TP53、EGFR、KRAS突变型别多达43、15、12种,而FGFR3、ERBB4、FGFR1突变型别均有且只有1种。除了EGFR、TP53,其他基因在同一样本单型别突变率均>90%。多基因突变个数在3种癌症组间的差异无统计学意义(P>0.05)。KRAS在结直肠癌的突变率较高(P<0.01),BRAF在恶性黑色素瘤的突变率较高(P<0.01)。结论 Ion Torrent测序技术准确性高、测序时间和成本低、操作简单,适合大规模地应用于恶性肿瘤的早期筛查和诊断、个体化治疗以及肿瘤基因的临床研究。