Ion Torrent PGM测序技术在MPN患者临床诊断中的方法学建立

目的:探讨通过自主设计定制的MPN致病相关基因的多重PCR引物试剂盒,使用Ion Torrent PGM第二代测序平台快速和准确地获取MPN患者基因突变信息的可行性和可靠性。方法:收集2015年1月至2015年10月就诊于南方医院血液科,经Sanger测序法检测JAK2V617F+和(或)CALR+、Ph-的10例MPN患者骨髓标本,然后使用Ion Torrent PGM第二代测序复核检测骨髓并对比两种方法结果的一致性。结果:Ion Torrent PGM第二代测序检测JAK2V617F、CALR和MPL就这3个基因而言,所有样本CALR基因52 bp缺失均未被检测出,其余测序结果与Sanger测序结果完全一致。结论:Lon Torrent PGM测序平台检测MPN患者多个基因突变,方法上具有可行性,能满足临床检测需求。本研究方法在1-2 d内可完成23个基因突变检测,具有灵敏、特异、快速、高通量及低成本的优势。

借助细胞流式仪进行枇杷基因组学测序材料的倍性鉴定

利用流式细胞仪进行测试枇杷品种的染色体倍数鉴定,并用低深度测序结果进行验证,据此为选择枇杷全基因组测序材料提供依据。结果表明,来自华南农业大学种质资源圃和四川石棉的‘大五星’均与‘解放钟’一样为二倍体,而来自四川农业大学的两份‘大五星’枇杷1号和188号材料均为三倍体。测序结果显示,来自华南农业大学资源圃的‘解放钟’枇杷为二倍体,773 Mb;而来自四川农大的‘大五星’枇杷1号和188号可能都为三倍体,基因组大小分别为749 Mb和765 Mb。以已确定基因组大小的植物萝卜、番茄和大豆为参照测定了‘解放钟’枇杷的基因组大小,结果为654.399 Mb。

通往个性化医疗的新一代测序技术:Ion Torrent

自1977年第一代Sanger测序法诞生以来,测序技术经历了突飞猛进的发展,第二代和第三代测序技术相继出现。随着测序仪代次的更迭,实现测序目的的技术权重已逐渐由偏重生化反应转向偏重物理学、材料学等非生物学科。Life Technologies公司推出的Ion Torrent Personal Genomic Machine(PGM)就是这类技术转型的代表。我们对测序技术的发展和Ion Torrent PGM的特点及应用做简要综述。

Ion Torrent测序技术检测Ⅰ型神经纤维瘤病患者NF1基因突变

目的评价Ion Torrent测序技术检测Ⅰ型神经纤维瘤(NF1)基因及其突变类型的可行性。方法提取12例NF1患者的外周血DNA,用Ion Torrent个体化基因测序仪(PGM)对患者NF1基因进行测序,用Sanger测序法验证NF1基因相应的突变位点,Ion Torrent PGM检测后覆盖缺失的外显子样本用Sanger测序法重新检测。结果检测到10例患者存在NF1基因致病突变,其中2种无义突变,5种小缺失或插入突变,1种错义突变,2种剪接突变。2例患者未检测到致病突变。结论 Ion Torrent测序技术检测含有大量外显子的NF1基因快速、准确;NF1基因突变可导致氨基酸密码子提前终止。

Ion Torrent PGM^(TM)测序在急性髓系白血病检测中的应用

目的探讨Ion Torrent PGMTM测序平台用于急性髓系白血病(AML)患者基因突变检测的可行性。方法提取27例AML患者初次治疗前的骨髓DNA,用Ion Torrent PGMTM测序仪对50个常见的肿瘤基因热点突变区进行检测,同时用Sanger测序法检测FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)和核仁磷蛋白1(NPM1)基因的突变情况以进行验证。结果 50个目标基因中检出17个基因共29个突变位点,单个基因有多种突变方式,以单碱基替换为主。突变频率最高的是NPM1(22.2%)和FLT3(18.5%)。用Sanger测序法验证,NPM1两种方法检测的吻合度为100%,在FLT3验证中,其中有1例Sanger测序为阳性,而Ion Torrent PGMTM检测为阴性。结论 Ion Torrent PGMTM能够在短时间内得到AML患者的基因突变谱,但其在检测长片段插入/缺失中的缺陷仍需改进。

应用Ion Torrent半导体测序检测马凡综合征患者FBN1基因致病突变

目的:对3个马凡综合征(MFS)家系及1例MFS患者的原纤维蛋白1基因(FBN1)进行基因检测,以明确致病突变,为患者提供遗传咨询及产前诊断。方法:应用高通量Ion Torrent半导体测序技术对3个MFS家系的先证者及1例MFS患者的FBN1基因进行检测,筛选致病突变位点,并用Sanger测序法验证。对1例胎儿FBN1基因相应的位点进行检测,以明确其受累情况。结果:患者P1 FBN1基因检测到c.7125_7126 del TG杂合性缺失突变,为可疑致病位点;家系1患者FBN1基因检测到IVS 27-1G>C(c.3464-1G>C)杂合性突变,为致病突变;家系2患者FBN1基因检测到c.4981G>C(p.Gly1661Arg)杂合性错义突变,为致病突变,胎儿携带同样突变;家系3患者FBN1基因检测到c.1546C>T(p.Arg516Term)杂合性无义突变,为致病突变。结论:应用高通量Ion Torrent半导体测序技术检测到3个MFS家系及1个MFS患者的致病基因突变,为临床诊断及遗传咨询提供分子遗传学依据,并对1例胎儿进行了产前诊断。

应用ABI PRISM^(TM)310测序仪进行快速且经济的DNA测序

目的 使DNA测序更快速且经济。方法 根据测序模板的不同采取相应的测序方法 ,视具体情况调整测序反应条件 ,改进仪器的操作方法 ,减少测序反应体系及合理使用试剂。结果 对测序模板、测序条件和仪器操作的优化 ,可缩短测序时间 ;充分利用试剂 ,可降低测序成本。结论 在保证测序质量的前提下 ,不仅快速而且经济。

ABI3130xl全自动测序仪规模化测序的影响因素研究

【目的】提高利用ABI3130xl全自动测序仪对小麦与条锈菌互作的cDNA文库进行大规模测序的成功率,降低成本。【方法】将BigDye(BigDye(Teminator V3.1 Cycle Sequencing RR-100)分别稀释16,24和32倍设计测序的PCR反应体系,分析了EDTA溶液(125 mmol/L,pH 7.0)和醋酸钠溶液(3 mol/L,pH 5.2)以及不同模板类型等相关因素对测序结果的影响。【结果】BigDye稀释16倍的PCR反应体系的测序结果易出现染料峰,影响碱基正确读值;稀释32倍体系的测序结果中可用序列短,成功率低;稀释24倍体系测序结果的可用序列长且准确率高,为最佳反应体系。EDTA溶液和醋酸钠溶液可提高DNA纯化的质量,改善测序效果。以质粒DNA为模板测序较PCR产物直接测序效果好,通过控制模板质量可以提高测序成功率。【结论】利用优化体系共测得15 000条ESTs序列,其中有高读长序列13 080条,占87.2%,表明该优化体系简单有效,且可有效节约成本。

Ion Torrent测序检测非小细胞肺癌外周血DNA的临床价值

目的:探讨Ion Torrent测序检测非小细胞肺癌外周血DNA的临床价值。方法:选择患者80例,分为两组,各40例,观察组利用三代测序技术Ion Torrent检测,对照组使用第1代测序技术Sanger末端终止法进行测序,比较手术前后通过Ion Torrent测序所得EGFR和K-ras结果,并统计两组测序EGFR阳性1年生存情况。结果:未手术者观察组EGFR阳性和K-ras突变阳性检出率均显著高于对照组(P<0.05),术后复发患者观察组EGFR阳性和K-ras突变阳性检出率均显著高于对照组(P<0.05),观察组1年生存率显著高于对照组(P<0.05)。结论:对非小细胞肺癌患者使用Ion Torrent测序技术测定外周血DNA,能更准确的确定患者基因类型,从而为分子靶向治疗提供依据。

二代高通量测序仪在大规模地中海贫血基因检测的应用价值

目的探讨二代高通量测序仪在大规模地中海贫血基因检测的应用价值。方法随机选取我院收治的疑为地中海贫血患者1368例作为研究对象,采用二代高通量测序仪检测地中海贫血基因,同时以GAP-PCR和RDB-PCR方法检测常见地贫突变,以Sanger测序验证,并对检测结果进一步分析。结果 1368例样本中一共检出了523例(38.2%)共25种地中海贫血基因突变。常规基因检测阴性而NGS测序阳性结果经Sanger测序结果一致。结论二代高通量测序仪对疑为地中海贫血患者进行地中海贫血基因大规模筛查的应用具有通量高的特点,值得在临床上推广应用。

二代测序技术454测序仪模拟测序算法

随着环境基因组学及深度测序技术的发展,基于16SrRNA基因序列研究微生物种群结构取得了长足进展。然而,由于环境样本的复杂性,尤其缺少真实背景信息,定量研究环境微生物种群结构仍是当前的研究难点。测序算法仿真平台研究,不仅有助于定量、定性分析微生物种群组成及结构,而且有助于建立基准数据库来评价当前微生物数据分析算法。分别基于易错PCR误差模型和正态分布过程,模拟454测序仪乳液PCR过程及边合成边测序过程,提出454测序仪模拟测序算法(Tsim)。仿真结果表明:该模拟算法能较好地模拟454测序过程。

第二代基因测序仪的硬件设计

随着基因序列分析研究的深入,中短基因片段的快速准确测序已经成为生物信息研究的瓶颈。本文针对第二代基因测序仪的硬件设计问题,在深入研究第二代基因测序原理和流程的基础上完成了硬件总体方案设计。此方案采用自上而下逐步分解的方法,设计了流动槽、PCR、边合成边测序、控制与数据传输等硬件模块,继续分解设计了温度控制、试剂控制、激光触发、光学采集、扫描控制等硬件子模块,并根据各个子模块的功能和厂商的产品说明书完成了部分关键器件的选型。为后续基因测序仪的机械结构设计和硬件组装奠定了基础。

超声波破碎仪在高通量测序中的应用

高通量测序技术中的数据质量控制是测序过程中的重要问题,样本文库的质量则是获取高质量的测序数据的前提和基础。在各种样本文库的制备过程中,样本的片段化过程受到普遍关注。该文主要针对基因组DNA样本的片段化技术中,涉及到的非接触式全自动超声破碎仪Bioruptor和自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220的使用技巧和仪器的优缺点进行了初步比较。

高通量基因测序仪行业标准的验证

目的按照制定的高通量基因测序仪行业标准的性能指标,使用测序通量<20 Gb/run且≥2 Gb/run高通量基因测序仪进行验证。方法取测序仪性能评价用脱氧核糖核酸国家参考品的DNA,经过DNA片段化处理、末端修复、接头连接和文库扩增等步骤后构建文库;然后将文库PCR扩增;最后使用测序反应通用试剂盒(半导体法)和BES4000基因测序仪进行测序。结果测序覆盖率为99.99%,测序平均深度为166×。国家参考品中人基因组DNA样本的比对率为86.14%,碱基测序准确率为98.97%;SNP、Indel准确率为95.40%;SNP、Indel灵敏度为85.75%。人基因组DNA、人乳头瘤病毒11型基因组DNA、大肠杆菌基因组DNA和高GC含量细菌基因组DNA样本的一致序列准确率分别为99.94%、100%、99.95%和99.88%。国家参考品进行三次重复测序,重复性结果均符合要求。结论制定的行业标准可以用于高通量基因测序仪的性能评价,为产品注册检定及上市后监督管理提供依据。

377型DNA测序仪常见问题解析

美国应用生物系统公司生产的 3 77型 DNA测序仪是目前应用最广泛的 DNA测序仪之一。本文根据作者长期的实践经验 ,在介绍该仪器的工作原理与特点的基础上 ,重点对该仪器在应用实践中容易出现的问题进行了详细的分析与总结 ,同时提出了切实可行的解决办法 ,从而有利于深入了解该仪器的性能 ,进一步提高

Ion torrent半导体测序技术在胎儿非整倍体疾病筛查中的应用

选择行无创产前检测的孕妇共6 064例,利用Ion torrent半导体测序技术进行孕妇外周血胎儿游离DNA检测,并对阳性病例进行羊水染色体核型分析,对所有研究病例随访新生儿结局。检测结果异常者共49例,其中21-三体综合征27例、18-三体综合征18例、13-三体综合征4例。其灵敏度和特异度分别为:21-三体综合征96. 3%、95%,18-三体综合征100%、93. 3%,13-三体综合征100%、100%。具有较高的灵敏度及特异度,有较高的推广价值。同时,该技术仍存在一定的假阳性及假阴性,应进一步结合其他产前诊断方法做出更准确判断。

DNA测序仪应用性相关指标初探

DNA测序仪是目前法医DNA检验技术的重要检验仪器,目前尚无文献有关DNA测序仪应用性能指标的报道。本文根据以往的实验经验和现有的文献资料,针对自主研制的DNA测序仪提出了几个判定仪器应用性能的指标,以期为DNA测序仪的整体性能测试,后续研发和扩大生产提供可参考的建议。

测序仪性能评价用脱氧核糖核酸国家参考品的建立

目的建立测序仪性能评价用脱氧核糖核酸国家参考品。方法分别将扩增培养后的永生化的人细胞系、培养达到10^(8)数量级的转染HPV11质粒的细菌、大肠杆菌和欧陆森氏菌高GC菌株收集后提取基因组DNA,然后进行DNA浓度测定。接着将人基因组DNA、HPV病毒基因组DNA、大肠杆菌基因组DNA和高GC菌株基因组DNA分别按照20、5、50、50 ng/μl终浓度要求,进行分装,制备国家参考品。在不同的基因测序仪进行上机测序,包括BGISEQ-500、NextSeq CN500、NovaSeq 6000和BioelectronSeq 4000等。构建人全基因组变异标准集和一致性序列。采用不同测序平台进行协作标定,评价变异标准集和一致性序列的适用性。结果制备的国家参考品经不同平台测序后构建了人全基因组变异标准集和一致性序列。经过不同测序平台标定,结果符合人全基因组变异标准集和一致性序列的要求。结论测序仪性能评价用脱氧核糖核酸国家参考品可以用于高通量基因测序仪的性能评价,为产品注册检定及上市后监督管理提供依据。