不同对虾种间共用微卫星DNA引物的研究

采用已发表的斑节对虾的30对微卫星引物,对部分微卫星引物在中国对虾、凡纳对虾、日本对虾中的通用性进行了研究。通过所建立的降温PCR(Touchdown PCR)方法对3种对虾的DNA进行PCR扩增,筛选出3对引物在3种对虾中均能产生清晰谱带。根据上述结果适当调整PCR反应体系中各试剂的量及反应条件,达到了理想的结果。利用这3对引物对3种对虾进行遗传标记分析,结果显示,PCR扩增产物条带清晰,特异性强,每对引物在3种对虾间扩增出的特异性片段大小几乎一致。研究表明,3种对虾基因组间存在一定程度的相似性,引物W15-16、W21-22和W45-46可直接应用于中国对虾、凡纳对虾、日本对虾、斑节对虾分子标记的基因组比较作图,也为图谱克隆法提供了新的思路。

改良的降落PCR与普通PCR结果比较

目的 :设计并验证一改良的降落ＰＣＲ(ＭＴＤ ＰＣＲ)程序。方法 :自盐藻ｂａｒｄａｗｉｌ中提取基因组ＤＮＡ作为ＰＣＲ模板 ,使用ＴａｑＤＮＡ聚合酶及ｐｆｕＤＮＡ聚合酶 ,运用普通ＰＣＲ和ＭＴＤ ＰＣＲ程序 ,扩增胡萝卜素生物合成相关基因 (ｃｂｒ)上游启动子序列 ,并电泳比较ＰＣＲ扩增产物的特异性。结果 :使用普通Ｔａｑ酶进行ＰＣＲ ,普通ＰＣＲ程序产生2 0 0ｂｐ , 50 0ｂｐ和 1 2 72ｂｐ的 3条带 ,而ＭＴＤ ＰＣＲ程序仅克隆出 1 2 72ｂｐ的特异带 ;利用高保真的ｐｆｕＤＮＡ聚合酶作ＰＣＲ ,在ＭＴＤ ＰＣＲ泳道中也仅有 1 2 72ｂｐ 1条带 ,而普通ＰＣＲ除了产生 1 2 72ｂｐ的特异带外 ,还出现 1条 50 0ｂｐ的非特异带。结论 :无论使用普通Ｔａｑ酶或高保真酶ｐｆｕ,改良的ＭＴ ＰＣＲ程序均明显提高ＰＣＲ的特异性 ,提示它可用于克隆普通ＰＣＲ难以克隆的基因片段 。

苹果不同HRM反应体系分析效果评价

高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)分析是一种新型的DNA多态性快速筛查技术。本研究以苹果品种"富士"和"舞姿"为试材,用来自苹果基因组的SSR标记CH03d11对不同反应体积、不同DNA浓度以及不同PCR退火程序下的HRM分型效果进行了测试与评估。结果表明:采用5μL反应体积可以获得与10μL或20μL反应体积相同的检测效果。在5μL反应体积中,DNA浓度小到0.25ng/μL时,PCR扩增及随后的HRM分析效果依然良好。另外,研究表明,采用降落PCR扩增模式也能取得良好的HRM多态性检测结果。

水稻花药绒毡层特异表达启动子的分离与表达载体构建

从籼稻川75A(OryzasativaL.)黄化苗叶片中直接提取基因组总DNA.根据文献报道的水稻花药绒毡层特异启动子Osg6B序列设计引物,采用TouchdownPCR技术获得水稻花药绒毡层特异表达的启动子Tsp1,将该片段克隆在载体pMD18-TVector上转化到大肠杆菌JM109,并酶切和PCR验证.序列分析发现,该片段与Osg6B启动子同源性为96%,且具有真核生物启动子的多种特征序列,表明启动子Tsp1为来源于籼稻川75A中的水稻花药绒毡层特异表达的启动子.利用该启动子对本实验室保存的质粒pIB467和pIB009进行改造,构建了一个可产生新型雄性不育系的双元植物表达载体pJH401.

J亚群禽白血病病毒TD-PCR检测方法的建立及初步应用

采用J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染DF1细胞提取的总DNA作为模板,以H5和H7为特异性引物,建立检测ALV-J的降落PCR(TD-PCR)方法,并对反应体系进行优化。结果表明:建立TD-PCR方法灵敏度高、特异性强,可检测0.105 ng的DNA,该方法与网状内皮组织增生症病毒、马立克病病毒、鸡贫血病毒及I群禽腺病毒没有交叉反应。运用TD-PCR、ELISA以及病毒分离对临床病料进行检测,TD-PCR方法与ELISA检测结果一致(100%),均比病毒分离检出率(75%)高。证明TD-PCR检测ALV-J的方法具有快速、灵敏、特异等优点,可满足临床、生产实际检测的需要。

冠突散囊菌有性孢子发育基因veAcDNA片段的克隆

为从冠突散囊菌中克隆到与有性发育相关的veA基因片段,根据genbank中不同种真菌的veA相关蛋白质序列同源性,设计简并引物,运用touchdown PCR技术,研究了从冠突散囊菌总RNA中克隆有性孢子发育基因veAcDNA片段。结果表明:克隆得到长度为558 pb的cDNA片段。该cDNA片段与棒曲霉veA基因相似性最高,为77%;与构巢曲霉ve A相似性67%。确定为冠突散囊菌veA基因片段。

一种改良的扩增cDNA5′末端的方法

介绍一种改良的扩增基因5′cDNA序列的方法(改良TdT加尾扩增法)。以龙眼为材料,采用TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)加尾、锚定PCR、巢式PCR、降落PCR等多种策略。通过与常规方法(用TaKaRa试剂盒)对比试验,发现该方法原理简单,操作性强;扩增特异性高,结果真实可靠;同时还具有快速低廉的特点,适合在一般实验室中推广使用。

降落-重叠PCR法四重融合构建平菇同源重组片段

对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法.本文提出一种新的融合PCR策略,即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序,减少不适当的退火温度和PCR产物3'端额外碱基A对片段融合、扩增的影响,提高正确融合与扩增的效率.结果表明,为构建平菇葡聚糖合成酶启动子的同源重组序列,在4个长度分别是1 015 bp、2 822 bp、2 206 bp和1 008 bp的片段进行融合时,在重叠PCR的第1步加上退火温度61.5℃～57.5℃、每降落0.5℃进行1个循环的降落PCR程序,在重叠PCR的第2步加上退火温度60℃～56℃、每降落0.5℃进行1个循环的降落PCR程序,经过1次PCR即获得顺序正确的全长融合片段.测序结果与4个片段序列的一致性达到98.5%,降落-重叠PCR法对多个长片段的基因融合具有较高的应用价值.

一种高特异性的改良降落PCR(英文)

为提高基因组DNA中的基因PCR检出的特异性,设计了一种改良的降落PCR程序,并分别用TaqDNA聚合酶及高保真PfuDNA聚合酶进行实验.自盐藻Dunaliellabardawil中提取基因组DNA作为PCR模板,使用TaqDNA聚合酶及PfuDNA聚合酶,运用普通PCR和降落PCR程序,扩增胡萝卜素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列,并电泳比较PCR扩增产物的特异性.结果显示,使用普通Taq酶PCR,普通PCR程序产生200bp,500bp和1272bp长的三条带,而TD PCR程序仅克隆出1272bp的特异带;利用高保真的PfuDNA聚合酶作PCR,在TD PCR泳道中仅有1272bp一条带,而普通PCR除了1272bp的特异带外,还出现一条500bp的非特异带.无论使用普通Taq酶或高保真酶Pfu,改良的降落PCR程序均明显提高PCR的特异性,类似的降落PCR程序可望用于克隆用普通PCR难以克隆的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性.

多重降落PCR检测血流感染产ESBLs肠杆菌科细菌与MRSA方法的建立和应用

目的探索一种可同时检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的肠杆菌科细菌与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的多重降落PCR方法。方法收集某院20l3年3月—2014年9月102份住院患者血培养阳性标本,针对产ESBLs肠杆菌科细菌的SHV、TEM、OXA基因和MRSA的MecA基因设计4对特异性引物,分别采用单一降落PCR和多重降落PCR对各耐药基因进行扩增,并将结果与药敏纸片法进行比较。结果各单一PCR均可扩增出特异性条带,并用多重降落PCR同时检测了4种耐药基因;建立的多重降落PCR对4种耐药基因(MecA、SHV、TEM、OXA)DNA的检测下限分别为4.37、2.19、4.53和3.59 ng。与药敏纸片法相比,多重降落PCR总灵敏度与特异性分别为100.00%、88.24%,检测ESBLs的灵敏度达100.00%,特异性为87.23%,检测MRSA的灵敏度和特异度均为100.00%。结论该实验建立的多重降落PCR具有高灵敏度与特异性,可用于产ESBLs肠杆菌科细菌和MRSA所致血流感染的快速诊断与流行病学调查,有利于指导临床使用抗菌药物。

尖吻蝮蛇未知C类凝集素蛋白cDNA扩增、克隆与表达

蛇毒中C类凝集素 (C TLs)超家族蛋白 ,是具有抗凝血等功能的一族蛋白质 .根据测得的蛇毒蛋白的N端氨基酸序列 ,设计PCR引物 ;从湖南尖吻蝮蛇毒腺中提取总RNA ,经反转录 ,再通过温度降落锚式PCR ,在只使用一个特异性引物和一个通用引物、进行一次循环数不超过 30的非巢式反应的条件下 ,即获得两个较为清晰的扩增条带 ;其中之一带经克隆、测序、比较 ,证明其与已知的蛇毒中C类凝集素超家族蛋白质有较高的同源性 .在大肠杆菌中获得高效融合表达 ,融合蛋白占细胞总蛋白的 2 6 %～ 30 %

重庆地区汉族CD14启动子区多态性分析

目的 调查CD14 ( 2 60 )多态性在重庆地区汉族中的分布特征 ,及检验该随机样本遗传学研究的可靠性。方法 对 110名重庆汉族个体 ,采用降落式PCR和限制性片段长度多态性法 (RFLP)进行基因型分析。结果 重庆地区汉族CD14 ( 2 60 )多态性TT、TC、CC 3种基因型频率分别为 43 6%、3 9 1%和 17 3 %;样本分布符合Hardy Weinberg平衡。结论 重庆汉族CD14 ( 2 60 )多态性基因型分布特征与白种人存在明显差异。样本为H W平衡群体 。

Diego血型基因分型方法的建立及西安地区多态性分布研究

目的建立降落PCR技术检测Diego血型基因的方法,并对西安地区献血者Diego血型基因多态性分布进行分析研究,同时建立Diego稀有血型库。方法建立了降落PCR检测Diego血型基因的方法,并采用抗-Dia和商品化基因分型试剂盒进行验证,以及基因测序做进一步确认。对西安地区1068名献血者提取基因组DNA,进行Diego血型基因分型。结果建立了检测Diego血型基因的降落PCR方法,用此方法共检测到Di(a+b-)1例,Di(a+b+)52例,Di(a-b+)1 015例,未检测到Di(a-b-)样本。献血者中Dia抗原的表达频率为0.049 63,Dib抗原的表达频率为0.999 06。结论本研究成功建立了降落PCR技术检测Diego血型基因的方法,并对西安地区献血者的Diego血型进行筛查和分析,获得其多态性分布数据。

基于兼并引物的PCR扩增特定基因的效果比较

根据NCBI上的DNA拓扑异构酶Ⅱ基因序列设计兼并引物,采用常规PCR、降落PCR、巢式PCR三种方法扩增糙皮侧耳和阿魏侧耳的拓扑异构酶Ⅱ部分基因序列,比较三种方法扩增效果的特异性、灵敏度.结果表明,巢式PCR的灵敏度和特异性都优于常规PCR和降落PCR,并且巢式PCR的灵敏度是常规PCR灵敏度的100倍以上,更加适合兼并引物扩增.这对利用兼并引物获取特异基因具有指导意义.

长片段基因FMNL2 PCR实验的体会

目的尝试扩增长片段FMNL2基因。方法采用巢式PCR或和降落PCR相结合的方法进行了FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT的扩增。结果高效、特异地扩增出FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT片段。结论巢式PCR或和降落PCR相结合,提高了目的基因的扩增效率和扩增产物的特异性。

猕猴结核分枝杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立猕猴结核分枝杆菌PCR快速检测方法。方法根据GenBank中报道的人型结核分枝杆菌标准株H37RV全基因序列,针对其中致病性结核分枝杆菌所特有的保守区域ESAT-6设计一对引物进行Touchdown PCR反应,利用此方法对100份野生来源猕猴全血标本进行检测,并与传统的PPD实验和咽拭子抗酸染色实验结果作比对。结果抽取33份野生来源猕猴的外周血,提取DNA进行扩增,扩增片段经纯化、回收克隆测序后用BLAST软件进行同源性对比,与GenBank中报道的序列基本相同,检测标本中有4份(4/33)为阳性,其中3份(3/33)标本与结核菌素试验和咽拭子抗酸染色试验结果相符合。结论建立了从猴全血中直接检测猴结核分枝杆菌DNA的Touchdown PCR方法,具有敏感性和特异性高,且简便的优点。

改良的降落PCR扩增中国地鼠目的基因

目的优化PCR程序,尝试用降落PCR扩增中国地鼠目的基因。方法设计了4对引物,用普通PCR和改良的降落PCR扩增中国地鼠COX1、COX2、NADH5、NADH6部分基因。结果普通PCR只有1对引物扩增出特异性条带,而降落PCR4对引物都扩增出特异性条带,并与中国地鼠目的基因大小一致。结论降落PCR省略了常规PCR中摸索最适退火温度的过程,对中国地鼠一些Tm值相近的基因可以使用降落PCR温度程序扩增,是一种行之有效的PCR方法。

降落和重叠延伸PCR构建靶向肿瘤干细胞腺病毒载体及感染实验

目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1.KNOB△HI,同时在缺失HI环部位引入EcoRV限制性酶切位点。在此基础上,用降落PCR克隆纤毛基因全长编码区序列,构建出腺病毒穿梭质粒pNEB-F5。利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性。再与pAdEasy-1,pShuttle-GFP在E.coli BJ5183中同源重组,得腺病毒载体Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP。用Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP分别感染CD133+人大肠癌细胞株SW480,通过荧光显微镜观察感染效率。结果降落PCR和重叠延伸PCR都扩增出特异性条带,测序结果与预期相符。与Ad5-GFP相比,Ad5FHI-GFP对CD133+人大肠癌细胞株SW480有显著提高。结论利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,其对CD133+人大肠癌细胞株SW480实验显示Ad5FHI-GFP组感染效率明显强于Ad5-GFP组。

多元PCR在黑鲍(Haliotis rubra)微卫星遗传研究中的应用

根据D03等11个微卫星引物单位点PCR扩增时优化的扩增条件(退火温度、MgCl2等)和11个微卫星引物所带有的荧光颜色、等位基因大小变异范围及反应的灵敏度,可将11个微卫星引物分成A组(D03、G04、B04和H08)、B组(A09、H11、A08和G01)和C组(CmrHr1.24、CmrHr2.30和CmrHr2.23)进行多元PCR扩增,结果显示各组内位点之间的分离清晰,这表明多元PCR可以大大提高微卫星检测仪器的使用效率和提高实验效果,在微卫星研究中是一种快速便捷的方法。

应用降落PCR及克隆测序检测2型糖尿病外周血白细胞胰岛素样生长因子受体IGF1R基因甲基化

目的:比较应用降落PCR(TD-PCR)及克隆测序检测2型糖尿病患者外周血白细胞中胰岛素样生长因子受体(IGF1R)基因启动子区DNA甲基化位点的方法。方法:提取2型糖尿病患者外周血白细胞DNA进行亚硫酸氢盐处理,设计引物扩增IGF1R基因启动子区富含CG位点序列,分别行普通PCR和TD-PCR扩增,对含目的条带产物进行直接测序和克隆后测序。结果:与普通PCR扩增结果相比,TD-PCR扩增条带清晰、产物量多、二聚体少;且TD-PCR减少了对退火温度不断摸索的过程。克隆后测序峰图清晰,碱基丢失错判频率减少。结论:推荐应用TD-PCR检测亚硫酸氢盐处理的DNA甲基化位点,并进行克隆后测序。